多紋錢蝶魚源海豚鏈球菌的分離鑒定及滅活疫苗的免疫效果?

尚 忠,唐 磊,2,王連慧,黃 海,茅云翔,莫照蘭,2??

(1. 中國海洋大學三亞海洋研究院,海南省熱帶水產種質重點實驗室,海南 三亞 572024;2. 中國海洋大學海洋生命學院,海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室,山東 青島 266003;3. 海南熱帶海洋學院水產與生命學院,熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室,海南 三亞 572022)

多紋錢蝶魚(Selenotocamultifasciata)俗稱銀鼓魚,屬鱸形目(Perciformes)鱸亞目(Percoidei)金錢魚科(Scatophagidae)錢蝶魚屬(Selenotoca),是廣溫、廣鹽、偏植食性的海水雜食性魚類。由于其生長快、肉質細嫩、易于飼養,兼具觀賞和食用價值等特點,深受廣大養殖戶和消費者喜愛,具有較高的經濟價值。海南的地理環境優勢使其成為多紋錢蝶魚種苗生產和養殖主產區,魚苗的規模化養殖在海南陵水,其大部分魚苗向廣西、廣東、福建、湖北等地推廣,其已經成為海南的一項億級產業。目前廣東、廣西、福建及浙江等地也開始在網箱和池塘中大量養殖。根據本實驗室前期的流行病學調查發現,海南多紋錢蝶魚養殖場海豚鏈球菌病頻發,從而引起該魚大量死亡,給養殖場造成了嚴重的經濟損失。為保障該產業的穩定持續發展,亟需開展多紋錢蝶魚海豚鏈球菌病的防控技術研究。

海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)屬芽孢桿菌綱(Bacilli)乳桿菌目(Lactobacillales)鏈球菌科(Streptococcaceae)鏈球菌屬(Streptococcus),是兼性厭氧型革蘭氏陽性球菌。該菌能夠使魚類感染鏈球菌病(Streptococcosis),病魚通常表現為眼球突出充血、體色發黑、游動失衡、缺氧、不攝食等,但也有部分魚感染后迅速死亡,幾乎無任何臨床癥狀[1-3]。在我國已報道發生海豚鏈球菌病的魚類有羅非魚(Oreochromismossambicus)[4]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[5]、鱘魚(Acipensersinensis)[6-7]、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[8]、多紋錢蝶魚[9-10]等。海豚鏈球菌分為兩種血清型,Ⅰ型菌株主要引起神經癥狀,Ⅱ型可導致全身性膿毒性疾病,且體內彌散性出血[11]。當前針對魚類海豚鏈球菌病的防治主要依賴抗生素藥物和疫苗免疫。由于抗生素會導致病原菌耐藥性產生,因此疫苗是控制水產養殖鏈球菌病發生與流行最為有效的途徑。國內外已開展了多種海豚鏈球菌疫苗的研究,包括滅活疫苗[12-14]、減毒活疫苗[15-16]、亞單位疫苗[17-18]以及DNA疫苗[19-20]。滅活疫苗因其安全性高和易于制備等特點在水產養殖應用的商品疫苗中占絕大多數。

本研究進行了海南多紋錢蝶魚鏈球菌病的調查,開展了海豚鏈球菌不同地理株的血清型、耐藥性、致病性研究,評價了不同菌株滅活疫苗的免疫保護效果,并進一步評價了1株強毒株的交叉免疫保護效果。獲得的研究結果將為多紋錢蝶魚鏈球菌疫苗研發打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用魚 用于病原分離的患病多紋錢蝶魚,取自2021年10月海南省陵水黎族自治縣某養殖場、2022年5月海南省東方市某養殖場,魚體長為8.00～15.00 cm、體質量為10.0～70.0 g。用于毒力測定及疫苗免疫實驗的多紋錢蝶魚,購自海南東方某養殖場,平均體長為(10.00±1.00) cm,平均體質量為(20.0±5.0) g,在實驗室養殖箱(45 cm×33 cm×30 cm)中持續充氣暫養,養殖水溫(25±1) ℃,鹽度30±1,每天換水50%。

1.1.2 實驗菌株 鏈球菌菌株LSSM分離自海南陵水黎族自治縣養殖場患病的多紋錢蝶魚,DFSM分離自海南東方市養殖場患病的多紋錢蝶魚,GXTO分離自廣西患病的卵形鯧鲹,GXAS分離自廣西養殖場患病的鱘魚,以上菌株名稱均為首次命名。所有菌株在-80 ℃保藏。

1.1.3 實驗試劑 腦心浸液(Brain heart infusion,BHI)培養基和Muller-Hinton agar(M-H)培養基購自北京索萊寶科技有限公司;革蘭氏染色試劑購自青島海博生物技術有限公司;羊血瓊脂平板培養基購自北京陸橋技術有限公司;藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司;PCR試劑購自南京諾唯贊生物科技有限公司;引物合成由上海生工生物工程有限公司完成;甲醛溶液購自國藥集團化學試劑公司。

1.2 病害調查及海豚鏈球菌的分離鑒定

1.2.1 病害調查 于2021年10月在海南省陵水黎族自治縣某養殖場、2022年5月在海南省東方市某養殖場開展了多紋錢蝶魚的養殖病害調查,記錄了養殖模式、水質條件、發病時間和死亡情況等數據。

1.2.2 細菌的分離培養和形態觀察 每次調查取5～10尾瀕死病魚,觀察記錄病魚的典型癥狀,無菌條件下對瀕死病魚進行解剖,取其肝臟、脾臟及腎臟劃線接種BHI平板,28 ℃培養箱倒置培養24～72 h,挑取優勢菌進行純化,獲得純化菌株。將純化的菌株接種于BHI平板上,28 ℃培養72 h后觀察菌落形態;挑取單菌落制備成菌懸液滴于羊血平板,于28 ℃倒置培養48 h,觀察溶血環;將制備的菌懸液滴片后進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 細菌的16S rDNA序列測定與分析 采用細菌的16S rDNA通用引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1 492R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’擴增菌株的16S rDNA序列。目的條帶送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。測序結果經NCBI的Blast檢索系統(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行序列比對和同源性分析,選取海豚鏈球菌以及近緣種等相關序列,利用MEGA軟件進行多重排列并構建系統發育樹,重復數1 000次,用Neibor-Joining方法繪制進化樹。

1.3 血清型鑒定

參考Bachrach等[11]的方法,采用隨機擴增多態性DNA(RAPD)確定海豚鏈球菌菌株的血清型。引物為LP:5’-GATCAAGTCC-3’。可以擴增出750 bp目的條帶的菌株判定為血清Ⅰ型,沒有該條帶的判定為血清Ⅱ型。

1.4 耐藥性試驗

采用K-B紙片擴散法[21]對海豚鏈球菌菌株進行30種常用抗生素的藥敏實驗。取1×108CFU/mL的菌液100 μL均勻涂布于M-H培養基平板上,用無菌鑷子取藥敏紙片輕輕貼附于平板上,28 ℃培養24 h后測量抑菌圈直徑,實驗設置3個平行,取平均值。根據CLSI M100抗菌藥物敏感性試驗性能標準以及藥敏紙片說明書,確定海豚鏈球菌對各種抗生素的敏感性(S:高度敏感、I:中度敏感、R:不敏感或耐藥)。

1.5 人工感染實驗

將4株海豚鏈球菌培養液進行10倍稀釋,制備107、106、105、104、103CFU/mL稀釋度的菌懸液。將健康多紋錢蝶魚隨機分組,每組20尾。進行攻毒實驗時,取不同稀釋度的菌懸液注射魚背部肌肉,注射劑量0.1 mL/尾,對照組注射0.1 mL/尾的磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS)。實驗期間,養殖水溫(25±1) ℃,2 d換一次水,每次換水50%。注射后每天記錄發病癥狀和死亡情況,連續觀察7 d,并對病魚進行細菌的分離,統計累計死亡率,根據改良的寇氏標準法[22]計算半數致死量(LD50)。

1.6 海豚鏈球菌滅活疫苗免疫保護率的測定

1.6.1 滅活疫苗的制備和安全性檢測 將3株海豚鏈球菌(DFSM、LSSM和GXTO)用BHI液體培養基培養至OD600>0.5,然后加入甲醛溶液至終濃度為0.20%(v/v),該濃度為實驗室前期篩選(結果見附錄A),在160 r/min、28 ℃滅活。滅活24 h后,吸取100 μL滅活菌液在BHI培養基上分別進行平板涂布和液體培養,檢測滅活情況。進行安全性檢測時,取滅活的菌液腹腔注射多紋錢蝶魚,10尾/組,0.1 mL/尾,對照組注射0.1 mL/尾的PBS。實驗魚在正常養殖條件下觀察7 d,記錄癥狀及死亡情況。用滅菌PBS將滅活徹底、安全性合格的海豚鏈球菌滅活疫苗調節至OD600=0.5(濃度為1×108CFU/mL),放置4 ℃冰箱備用。

1.6.2 滅活疫苗的免疫保護率 將健康多紋錢蝶魚隨機分組,20尾/組,取1.6.1制備的滅活疫苗對魚進行免疫,腹腔注射,注射劑量0.1 mL/尾,免疫對照組注射0.1 mL/尾的BHI培養基,空白對照組注射0.1 mL/尾的無菌PBS溶液。免疫7 d后進行攻毒實驗,各組分別肌肉注射濃度為1 LD50的同源菌株。攻毒后觀察實驗魚癥狀、死亡情況等,統計累積死亡數,計算相對免疫保護率:相對免疫保護率=(1-免疫組死亡率÷對照組死亡率)×100%。本實驗進行兩次重復。

1.6.3 DFSM滅活疫苗的交叉免疫保護率 同1.6.2步驟,以LSSM、GXTO為毒株,對DFSM免疫組魚進行攻毒,計算相對免疫保護率。

2 結果與分析

2.1 病害調查及病原菌的分離鑒定

2021年10月海南省陵水黎族自治縣某養殖場、2022年5月海南省東方市某養殖場爆發了多紋錢蝶魚病害。2個養殖場該魚的養殖面積均在350～400 m2,有水泥池和戶外土塘2種養殖模式。發病時養殖水溫為28～30 ℃,鹽度為30±2,pH為7.8±0.2,溶解氧為(5.5±0.5) mg/L。陵水養殖場發病魚規格在8.0 cm左右,體質量10.0 g左右,死亡率達20%;東方養殖場發病魚規格在15.0 cm左右,體質量70.0 g左右,死亡率達70%。發病魚死亡前均離群、狂游、身體失衡、不攝食,外觀如圖1A—1D所示,表現為體色發黑,魚鰭基部、吻端發紅,眼球渾濁突出且充血,肛門紅腫;解剖癥狀如圖1E、1F所示,內臟器官粘連嚴重、有腹水、肝臟發白、有病斑。

(A: 發紅的鰭基; B: 發紅的吻端; C: 突出充血的眼球; D: 紅腫的肛門; E: 粘連的內臟器官; F: 發白的肝臟。A: Reddish fin base; B: Reddish snout; C: Prominent congested eyeballs; D: Red and swollen anus; E: Adhesive visceral organs; F: White liver.)圖1 自然發病多紋錢蝶魚的臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of the naturally diseased S. multifasciata

在海南陵水黎族自治縣和東方市2個不同養殖場患病瀕死的多紋錢蝶魚的肝臟、脾臟和腎臟分離得到2株優勢菌,分別命名為LSSM和DFSM。2株分離菌株均在BHI平板上得到形態大小一致、呈乳白色的菌落(見圖2A和2D)。取優勢菌落在羊血平板培養,菌落周圍出現透明的β溶血圈(見圖2B和2E)。在顯微鏡下觀察,分離菌株呈鏈狀球菌、革蘭氏染色陽性(見圖2C和2F)。

(A—C: 菌株LSSM的特征; D—F: 菌株DFSM的特征; A和D: BHI平板上的分離菌落形態特征; B和E: 羊血平板上的β溶血圈; C和F: 革蘭氏染色陽性。A—C: Characteristics of strain LSSM; D—F: Characteristics of strain DFSM; A and D: Morphological characteristic of colony of isolated strains on BHI plate; B and E: β hemolytic circle on sheep blood plate; C and F: Gram positive staining result.)圖2 分離菌株的形態特征及溶血性Fig.2 Morphological characteristics and hemolysis of isolated strains

對這2株菌株(LSSM和DFSM)與實驗室保藏菌株(GXTO和GXAS)的16S rDNA基因序列進行擴增和測序,得到的序列經過Blast同源性檢索,發現其與海豚鏈球菌同源性最高,相似性為99%。從中選取親緣關系相近的序列,利用MEGA軟件進行序列同源性分析和構建系統發育樹(見圖3),結果顯示4株菌與海豚鏈球菌聚為一支。經形態學與分子生物學鑒定,確定這4株菌均為海豚鏈球菌(S.iniae)。

圖3 菌株16S rDNA的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of stains

2.2 海豚鏈球菌的血清型鑒定結果

RAPD分型電泳圖結果顯示(見圖4),4株海豚鏈球菌(LSSM、DFSM、GXTO和GXAS)均可以擴增出750 bp的目的條帶(見圖4泳道1—4中方框圈出部分)。根據Bachrach等[9]建立的海豚鏈球菌的血清型劃分的方法,這4株海豚鏈球菌鑒定為血清Ⅰ型。

(M: 指示DNA; O: 空白對照; 1: LSSM; 2: DFSM; 3: GXTO; 4: GXAS; N1: 副乳房鏈球菌; N2: 哈維氏弧菌; N3: 美人魚發光桿菌殺魚亞種; N4: 假單胞菌; N5: 溶藻弧菌。M: Marker DNA; O: Blank control; 1: LSSM; 2: DFSM; 3: GXTO; 4: GXAS; N1: Streptococcus parauberis; N2: Vibrio harveyi; N3: Photobacterium damselae subsp. piscicida; N4: Pseudomonas adaceae; N5: Vibrio alginolyticus.)圖4 海豚鏈球菌的RAPD分型電泳圖Fig.4 RAPD typing electropherogram of S. iniae

2.3 海豚鏈球菌的藥敏試驗結果

對4株海豚鏈球菌菌株進行30種抗生素的藥敏試驗結果顯示,所有菌株均對青霉素類(羧芐西林、苯唑西林等)、頭孢類(頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢曲松等)、四環素、紅霉素、諾氟沙星、氯霉素、克林霉素等23種抗生素高度敏感,對丁胺卡那耐藥。不同地理菌株之間對抗生素的敏感性存在差異:海南株LSSM、DFSM菌株對慶大霉素和卡那霉素抗生素耐藥,而廣西株GXTO、GXAS則對慶大霉素和卡那霉素敏感(見附錄B的附表1)。

表1 海豚鏈球菌感染多紋錢蝶魚的LD50測定Table 1 LD50 determination of S. multifasciata after infection of S. iniae

2.4 人工感染實驗結果

以多紋錢蝶魚為實驗動物、以4株海豚鏈球菌為病原進行人工感染實驗,檢測菌株的毒力,實驗結果如表1所示。 LSSM、DFSM和GXTO的LD50分別為3.40×106、7.20×102和2.72×103CFU/尾,表明這些菌株在多紋錢蝶魚的毒力大小依次為:DFSM>GXTO>LSSM。在整個實驗過程中,GXAS攻毒組僅死亡1尾,不能計算出LD50,判定為弱毒力或無毒力。

根據以上結果,選擇具有明顯毒力的3株菌株(DFSM、GXTO和LSSM)進行后續的疫苗免疫保護效果評估實驗。

2.5 海豚鏈球菌滅活疫苗的免疫保護率

以3株海豚鏈球菌(DFSM、GXTO和LSSM)分別制備滅活疫苗,經腹腔注射途徑免疫多紋錢蝶魚,7 d后以同源菌株進行攻毒,攻毒濃度為1 LD50,測定各菌株提供的RPS。本實驗進行了兩次重復,攻毒后各組存活率如圖5、6所示。在第一次實驗中,攻毒7 d后,DFSM免疫組的累積死亡率為10%,對照組為70%;GXTO免疫組的累積死亡率為20%,對照組為65%;LSSM免疫組的累積死亡率為45%,對照組為75%。經計算得出,DFSM、GXTO和LSSM滅活疫苗提供的相對保護率分別為85.7%、69.2%和40.0%(見圖5)。在第二次實驗中,DFSM免疫組的累積死亡率為10%,對照組為65%;GXTO免疫組的累積死亡率為20%,對照組為70%;LSSM免疫組的累積死亡率為60%,對照組為90%。經過計算,DFSM、GXTO和LSSM滅活疫苗提供的相對保護率分別為84.6%、71.4%和33.3%(見圖6)。

(RPS: 相對免疫保護率 Relative percent survival rate。)圖5 實驗1中同源菌株攻毒后多紋錢蝶魚的存活率Fig.5 Survival rate of S. multifasciata after being challenged by homologous strains in Experiment 1

(RPS: 相對免疫保護率 Relative percent survival rate。)圖6 實驗2中同源菌株攻毒后多紋錢蝶魚的存活率Fig.6 Survival rate of S. multifasciata after being challenged by homologous strains in Experiment 2

為檢測DFSM株滅活疫苗提供的交叉免疫保護,以DFSM滅活疫苗免疫多紋錢蝶魚,7 d后以異源菌株LSSM、GXTO進行攻毒,結果如圖7所示。LSSM和GXTO異源攻毒后7 d,免疫組累積死亡率分別為10%和0,經計算得到的相對保護率分別為86.7%和100%。這個結果表明,DFSM滅活疫苗對LSSM和GXTO毒株具有很好的交叉免疫保護。

(RPS: 相對免疫保護率 Relative percent survival rate。)圖7 DFSM疫苗免疫組多紋錢蝶魚經異源菌株攻毒后的存活率Fig.7 Survival rate of the DFSM vaccinated S. multifasciata after infection by heterologous strains

3 討論

海豚鏈球菌作為重要的淡水、海水生物的病原菌,能夠感染多種經濟魚類。本研究對海南省兩個地區的多紋錢蝶魚養殖場暴發的病害進行調查,分離鑒定了2株海豚鏈球菌LSSM和DFSM,其引起的癥狀與羅璋等[9]和楊林狄等[10]研究報道一致。研究人員應用RAPD(Random amplified polymorphic DNA)方法,將海豚鏈球菌分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種血清型[11]。研究人員針對魚源海豚鏈球菌的血清型分型開展了相關工作,如黃婷等[23]將分離自廣西養殖羅非魚和卵形鯧鲹的22株海豚鏈球菌鑒定為血清Ⅰ型,麻強生等[24]將分離自甘肅省某養殖場雜交鱘(Acipenserschrenckii♀×Acipenserbaeri♂)的5株海豚鏈球菌鑒定為血清Ⅱ型。本研究將分離自海南多紋錢蝶魚、廣西卵形鯧鲹和鱘魚的4株海豚鏈球菌均鑒定為血清Ⅰ型,因此我們推斷海豚鏈球菌血清Ⅰ型為當前感染海南多紋錢蝶魚的流行株。下一步工作需要持續開展流行病學調查,分離收集更多的臨床菌株進行血清型分析,為選擇合適菌株制備疫苗提供參考。

本研究的4株海豚鏈球菌均對大部分抗生素敏感,對丁胺卡那耐藥。不同地理株對抗生素的敏感性存在差異,如海南株(DFSM、LSSM)對慶大霉素和卡那霉素耐藥,而廣西株(GXTO、GXAS)則對慶大霉素和卡那霉素敏感;DFSM和GXTO均對復方新諾明耐藥,而LSSM和GXAS則對復方新諾明敏感。不同地理株產生耐藥性的差異與養殖企業濫用抗生素有關。目前抗生素仍是我國水產養殖病害的主要防治措施,疫苗的開發與應用對于魚類養殖綠色健康可持續發展顯得尤為重要。

本研究通過人工感染實驗比較了4株海豚鏈球菌對多紋錢蝶魚的毒力。肌肉注射和腹腔注射病原是魚類常用的人工感染方法。在預實驗中,我們比較了兩種注射方法的感染效果,發現肌肉注射較腹腔注射對魚的刺激較小,可以減緩病程,利于發病癥狀的觀察和半數致死量的計算,因此本研究采用肌肉注射方式進行攻毒實驗。結果顯示,在這4株海豚鏈球菌中,來源于多紋錢蝶魚和卵形鯧鲹的3株菌(DFSM、LSSM和GXTO)表現出較強的毒力,而分離自鱘魚的菌株(GXAS)沒有毒力。多紋錢蝶魚和卵形鯧鲹在海水環境養殖,鱘魚在淡水環境養殖,我們認為是由于該菌株處在海水環境中,其生長或毒力受到影響的緣故,因此GXAS對多紋錢蝶魚沒有致病性。在本研究中,分離自多紋錢蝶魚的東方分離株DFSM的毒力強于陵水分離株LSSM;楊林狄等[10]從廣東地區患病多紋錢蝶魚分離到的海豚鏈球菌的LD50為1×105CFU/尾,其毒力介于DFSM菌株和LSSM菌株之間,這些結果說明來源于同種宿主的不同地理株之間也存在毒力差異。海豚鏈球菌存在多種毒力因子,如莢膜多糖[25]、溶血素[26]、葡萄糖磷酸變位酶[27]等,不同的環境因子可能影響了這些毒力因子的表達和調控,進一步影響了病原菌的毒力。

魚用滅活疫苗免疫接種途徑有注射、浸泡、口服,其中注射途徑獲得的免疫效果最好。腹腔注射和肌肉注射是常用的兩種注射接種方式。腹腔注射可以使疫苗抗原直接刺激魚的頭腎、脾臟等免疫器官,快速引起免疫應答和免疫反應,免疫效果好。通過肌肉注射的疫苗抗原需要通過血液循環呈遞到魚類的免疫系統,引起的免疫應答和免疫反應較慢,免疫效果較低。同時,與肌肉注射途徑相比,腹腔注射不容易引起疫苗流失,可以保證免疫劑量的準確和穩定。因此,在實際應用中,腹腔注射常用于魚用滅活疫苗的免疫接種,如吳明波[28]和Yan等[29]制備的魚類病原菌滅活疫苗,采用腹腔注射途徑,獲得了良好的免疫效果。為了獲得有效的免疫效果,在本研究中我們采用腹腔注射方式對多紋錢蝶魚進行免疫接種。國內外已經報道了多種魚類海豚鏈球菌滅活疫苗的研究和應用,例如,虹鱒(Oncorhynchusmykiss)海豚鏈球菌滅活疫苗使得虹鱒的死亡率由50%降至5%[12],雜交鱘海豚鏈球菌滅活疫苗的相對保護率可達到92.8%[30]。目前尚未有多紋錢蝶魚疫苗的報道。本研究制備了3株海豚鏈球菌(DFSM、LSSM和GXTO)滅活疫苗,檢測了它們為多紋錢蝶魚提供的免疫保護率,并進一步檢測了強毒株DFSM疫苗對異源菌株(LSSM、GXTO)的交叉免疫保護率。結果顯示,3種滅活疫苗的免疫保護率在33.3%～85.7%之間,其中強毒株DFSM提供的免疫保護率最高。DFSM滅活疫苗對2株異源菌株LSSM和GXTO的交叉免疫保護分別為86.7%和100%。因此,DFSM株是制備海南多紋錢蝶魚海豚鏈球菌滅活疫苗的理想候選株。

4 結語

本研究從海南不同的養殖場的患病多紋錢蝶魚中分離到2株病原菌LSSM和DFSM,經形態學和16S rDNA序列分析鑒定為海豚鏈球菌。與實驗室保藏的海豚鏈球菌(GXTO和GXAS)血清型均為血清Ⅰ型,海南株LSSM和DFSM對慶大霉素和卡那霉素抗生素耐藥,廣西株GXTO和GXAS則對慶大霉素和卡那霉素敏感;菌株DFSM、GXTO和LSSM對多紋錢蝶魚的半數致死量(LD50)分別為7.20×102、2.72×103和3.40×106CFU/尾,GXAS則沒有表現毒力。使用3株有毒株(DFSM、GXTO和LSSM)制備的滅活疫苗對多紋錢蝶魚進行免疫,各組免疫魚對同源菌株的相對保護率分別為84.6%～85.7%、69.2%～71.4%和33.3%～40.0%;強毒株DFSM滅活疫苗對異源菌株LSSM和GXTO的交叉免疫保護率分別為86.7%和100%;DFSM株制備的海豚鏈球菌滅活疫苗對同源和異源菌株的免疫保護效果均較好。上述結果為多紋錢蝶魚海豚鏈球菌病的防控和滅活疫苗的研發、應用奠定了基礎。

附錄A不同濃度甲醛對海豚鏈球菌的滅活

將3株海豚鏈球菌(DFSM、LSSM和GXTO)用BHI液體培養基培養至OD600>0.5,并調節OD600值基本一致。然后加入甲醛水溶液,使甲醛終濃度分別為0.10%、0.20%和0.30%,以28 ℃,140 r/min震蕩滅活,分別在12、24、36和48 h取樣進行滅活效果檢測。3株海豚鏈球菌滅活菌液各取100 μL進行平板涂布,28 ℃倒置培養,觀察48～72 h;取50 μL的菌液加到BHI液體試管中,搖菌培養24～36 h,觀察有無細菌生長。

在28 ℃滅活溫度下,3株菌株在0.10%、0.20%和0.30%甲醛濃度下,滅活12、24、36和48 h后,檢測結果見附表1。結果表明,當甲醛終濃度在0.20%時,3株海豚鏈球菌可在12 h內被完全滅活。

附表1 不同濃度甲醛對海豚鏈球菌的滅活效果Supplementary table 1 Inactivation effect of different concentrations of formaldehyde on Streptococcus iniae

附錄B