入侵種真江蘺保護(hù)性細(xì)菌與條件致病菌的分離與鑒定?

侯明磊,任藝飛,Luisa Düsedau,Florian Weinberger,王高歌??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東 青島 266003; 2. 中國海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所,山東 青島 266003; 3. 亥姆霍茲海洋研究中心海洋生態(tài)學(xué)部,德國 基爾 24105)

海藻作為初級(jí)生產(chǎn)者,在海洋生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色。海藻表面通常附生著大量的細(xì)菌,這些附生細(xì)菌在其海藻宿主的健康、發(fā)育和疾病中扮演著重要的角色[1]。一方面,一些表面附生細(xì)菌有利于其海藻宿主的形態(tài)、發(fā)育和生長[1-2]。另一方面,表面附生細(xì)菌也可能是有害的。例如,海藻表面的附生細(xì)菌群落中存在條件致病菌,當(dāng)光強(qiáng)、溫度、pH等環(huán)境因子發(fā)生變化時(shí),這些條件致病菌往往會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【?進(jìn)而引起病害的發(fā)生[3-5]。

海藻表面附生細(xì)菌的組成受到藻體宿主本身和環(huán)境因子(鹽度、pH及溫度等[6])的影響。溫度是海藻生長中非常重要的一個(gè)環(huán)境因子。前期研究表明,海水升溫會(huì)引起海藻表面附生細(xì)菌群落的變化。Stratil等[7]發(fā)現(xiàn),當(dāng)溫度從5 ℃上升到25 ℃時(shí),墨角藻(Fucusvesiculosus)表面附生細(xì)菌群落的操作性分類單元(Operational taxonomic unit,OTU)在15 ℃時(shí)的多樣性要高于其在5和25 ℃時(shí)的多樣性,但細(xì)菌數(shù)量卻隨著溫度的升高而增加,這可能會(huì)導(dǎo)致海藻宿主抗逆性的改變。Saha等[8]通過進(jìn)行進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),溫度從5 ℃上升到25 ℃的過程中,墨角藻藻體表面的二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽(Dimethylsulfoniopropionate,DMSP)含量會(huì)逐漸下降,導(dǎo)致條件病原菌在藻體表面定殖,部分藻體出現(xiàn)病爛現(xiàn)象。

真江蘺(Gracilariavermiculophylla)是一種原產(chǎn)于太平洋西北部的海洋紅藻。在過去的幾十年里,它成功入侵了歐洲、北美、南美等地區(qū)的多個(gè)沿海棲息地[9]。真江蘺的入侵對當(dāng)?shù)匮睾Ｈ郝浣Y(jié)構(gòu)、物種豐富度和生態(tài)系統(tǒng)功能造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響[10],被列為歐洲最具入侵性的海藻之一[11]。藻枝體白化是一些養(yǎng)殖或野生紅藻如江蘺屬(Gracilariaconferta)、卡帕藻屬(Kappaphycus)及野生紅藻(Deliseapulchra)的常見病癥[12-14]。研究證明,條件致病菌如創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)等可引起這種藻體脫色的病癥[13-15]。Saha與Weinberger[15]以健康的入侵種真江蘺為材料,分離、鑒定了58種可培養(yǎng)附生細(xì)菌,并進(jìn)行了侵染實(shí)驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)表明這些附生細(xì)菌可分為條件致病菌、保護(hù)性細(xì)菌和中性菌,條件致病菌可誘導(dǎo)真江蘺產(chǎn)生白化的病癥,保護(hù)性菌則能抑制條件致病菌產(chǎn)生白化病癥。這些研究結(jié)果表明,真江蘺表面附生細(xì)菌群落中的保護(hù)性細(xì)菌可保護(hù)其免受條件致病菌的侵染,也說明真江蘺在入侵過程中伴隨著保護(hù)性細(xì)菌的選擇。Li等[16]發(fā)現(xiàn)暗棕色桿菌屬的BS52(Phaeobactersp. BS52)是野生紅藻(D.pulchra)白化病致病菌的拮抗菌,能夠緩解由致病菌引起的D.pulchra表面附生細(xì)菌群落的變化,從而降低白化病的發(fā)病率。這些研究結(jié)果表明,有益菌對海藻宿主表面微生物群落的穩(wěn)定性發(fā)揮著重要的作用。

在全球氣候變化的背景下,預(yù)計(jì)到22世紀(jì),全球海水表面溫度將上升0.5～2.5 ℃,甚至上升到5 ℃[17]。鑒于表面附生細(xì)菌對真江蘺成功入侵具有重要的生態(tài)學(xué)作用,因此,有必要了解海水升溫對其表面可培養(yǎng)附生細(xì)菌的影響。本文運(yùn)用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法,分離并純化23和26 ℃條件下入侵種真江蘺表面可培養(yǎng)附生細(xì)菌,通過16SrRNA基因同源性分析進(jìn)行分離菌鑒定。通過侵染實(shí)驗(yàn),篩選出保護(hù)性細(xì)菌和條件致病菌。研究海水溫度升高對入侵種真江蘺表面可培養(yǎng)附生細(xì)菌群落的影響,可從全球變暖的角度來闡明未來海水升溫對入侵種真江蘺表面附生細(xì)菌的影響,填補(bǔ)該領(lǐng)域空白,同時(shí),本文篩選的保護(hù)性菌株也可為防控真江蘺白化病的爆發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 真江蘺實(shí)驗(yàn)材料的采集與處理

2019年5月22日,從德國基爾的Falkensteiner海灣(54°23′53.7″N,10°11′25.7″E)采集入侵種真江蘺個(gè)體。采集到的樣本保存在冷卻箱中,2 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至亥姆霍玆海洋研究中心實(shí)驗(yàn)室。將真江蘺樣本放置于5 L的水箱中,在室內(nèi)15 ℃、鹽度14(接近取樣地點(diǎn)的鹽度)條件下馴化7 d后,進(jìn)行溫度暴露實(shí)驗(yàn)。

溫度實(shí)驗(yàn)是于2019年5月28日—8月28日在德國基爾Helmhotlz海洋研究中心,通過人造海實(shí)系統(tǒng)(Benthocosm系統(tǒng))進(jìn)行的。該系統(tǒng)通過離海面1 m深處的管道,不斷供應(yīng)基爾海灣的海水;海水參數(shù)(溫度、pH和鹽度)的波動(dòng)通過內(nèi)部傳感器上傳至Benthocosm系統(tǒng),水箱中的海水溫度可由加熱系統(tǒng)自行控制。因此,可實(shí)現(xiàn)當(dāng)?shù)睾Ｋ疁囟鹊膶?shí)時(shí)模擬。本實(shí)驗(yàn)將室外水箱分為兩組,一組水箱里的溫度為模擬當(dāng)?shù)夭_的海的海水溫度,即正常溫度(Normal temperature,Nt),另外一組水箱的溫度則始終高于正常海水溫度3 ℃,即偏高溫度(Higher temperature,Ht);每個(gè)水箱里放入1個(gè)裝有1.0 g真江蘺的網(wǎng)兜,將網(wǎng)兜置于每個(gè)水箱的中心,讓真江蘺樣本盡可能地暴露在陽光下;Nt組和Ht組各有4個(gè)水箱,分別代表4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 真江蘺表面附生細(xì)菌的采集與分離培養(yǎng)

2019年8月28日,采集Nt組和Ht組中培養(yǎng)的真江蘺樣本。其中,Nt組約為23 ℃,Ht組溫度約為26 ℃。Nt組真江蘺的4個(gè)重復(fù)樣本的編號(hào)分別為Nt2、Nt3、Nt6和Nt11。由于實(shí)驗(yàn)過程中Ht組中有1個(gè)網(wǎng)兜里的真江蘺腐爛,因此只收集到了3個(gè)重復(fù)樣本,編號(hào)分別為Ht4、Ht9和Ht12。將真江蘺表面水分用無菌棉紗吸干,用無菌手術(shù)刀剪取1.0 g真江蘺個(gè)體。然后將每個(gè)樣品各放入一個(gè)裝有15 mL無菌海水和30 個(gè)滅菌玻璃珠的50 mL 離心管(品牌:Falcon)中。在轉(zhuǎn)速150 r/min下離心含有真江蘺樣品和玻璃珠的試管(品牌:Falcon)5 min,從而收集到含有真江蘺表面浮生細(xì)菌原液。然后將離心好的水樣轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的無菌離心管中,并避免將藻體和玻璃珠導(dǎo)入離心管中。

將懸濁液稀釋至原濃度的10-1、10-2、10-3、10-4和10-5,然后從每種稀釋液中各吸取60 μL,并分別涂布至5個(gè)含ZoBell 2216E 培養(yǎng)基及 1/2 ZoBell 2216E瓊脂平板上,放入23 ℃(Nt組分離的菌株)或26 ℃(Ht組分離的菌株)培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌落的形狀和顏色來挑取不同的菌株進(jìn)行劃線培養(yǎng),3次純化后,將培養(yǎng)后的菌液放入裝有30 %(v/v)甘油的1.5 mL 離心管中,并保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3 16S rRNA基因的擴(kuò)增與測序

將分離到的菌株分別接種于5 mL ZoBell 2216E培養(yǎng)基或5 mL 1/2 ZoBell 2216E培養(yǎng)基的滅菌離心管中。120 r/min 23 ℃黑暗條件下于震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d,從而使菌株分布均勻然后使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(供應(yīng)商:生工生物工程股份有限公司,上海),并按照操作說明書提取DNA。

使用NanoDrop ND-2000c微量分光光度計(jì)檢測DNA的濃度,以O(shè)D260/OD280在1.8～2.0之間的DNA為模板,16SrRNA基因通用引物為27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCA)和1 492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)。30 μL PCR反應(yīng)體系為:Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3 μL,10×buffer 3 μL,dNTP Mixture 4.8 μL,MgCl23 μL,引物27F(10 μmol/L)和1 492R(10 μmol/L)各0.6 μL,模板DNA 0.6 μL,加ddH2O至30 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測后,送往青島擎科生物科技有限公司進(jìn)行16SrRNA基因全長測序。測序結(jié)果通過EziBioCloud基因數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/)進(jìn)行對比分析。

1.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

如果2種細(xì)菌的基因序列一致性比對結(jié)果低于98.65%,可假定這2種細(xì)菌為不同的種[18]。采用Clustal W進(jìn)行序列比對,使用MEGA Ⅹ軟件利用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[19],進(jìn)化樹各分支的自舉檢驗(yàn)值(Bootstrap value)均是通過1 000次重復(fù)檢驗(yàn)獲得的。

1.5 侵染實(shí)驗(yàn)

真江蘺藻枝體尖端侵染實(shí)驗(yàn)于2020年8月27日—10月29日之間進(jìn)行,健康的真江蘺個(gè)體采集自青島海濱雕塑園附近(36°04′48.39″N,120°27′06.70″E)。將采集的真江蘺樣品保存在自封袋中,低溫4 h之內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室。然后將其保存在裝有20 L無菌海水的水箱中,室內(nèi)馴化5 d后用于侵染實(shí)驗(yàn)。馴化條件:23 ℃下持續(xù)充氧,光周期為12 h∶12 h (光∶暗),光照強(qiáng)度為75 μmol·m-2·s-1。

將保存在-20 ℃冰箱的分離菌株取出,解凍后吸取0.7 mL菌液接種至含有5 mL ZoBell 2216E液體培養(yǎng)基的滅菌離心管中。將Nt組和Ht組的菌株分開培養(yǎng),其中:Nt組菌株培養(yǎng)溫度為23 ℃,120 r/min; Ht組菌株培養(yǎng)溫度則為26 ℃,120 r/min。從而這兩組菌株均分布均勻,然后二者均在黑暗條件下震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后更換新的ZoBell 2216E培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),重復(fù)該步驟2～3次,最終使它們的OD610保持在0.2～0.3之間。

參考Saha和Weinberger[15]的侵染方法,將真江蘺藻枝體尖端侵染實(shí)驗(yàn)方法稍作改進(jìn),具體步驟為:(1)使用無菌手術(shù)刀將室內(nèi)馴化后的健康真江蘺個(gè)體的藻枝體尖端切成2～3 cm的片段,然后用滅菌鑷子分別向裝有2 mL無菌海水的24孔板中添加6個(gè)藻枝體尖端片段。向每個(gè)孔板中均添加20 μL萬古霉素和20 μL頭孢噻肟兩種抗生素(每種濃度為0.1 mg/mL),以除去真江蘺表面的附生細(xì)菌。(2)將加有抗生素的24孔板放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d (預(yù)處理)。培養(yǎng)條件:23 ℃,光照75 μmol·m-2·s-1,光周期為12 h∶12 h (光∶暗)。(3)準(zhǔn)備新的24孔板,并向每個(gè)孔里添加2 mL無菌海水。用滅菌后的鑷子將沖洗過后的藻枝體尖端放入24孔板中,立即添加20 μL OD610在0.2～0.3的菌液,每組設(shè)置6個(gè)重復(fù),對照組則添加20 μL無菌海水。(4)將經(jīng)步驟(3)處理的24孔板放置在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d (培養(yǎng)條件:溫度23 °C、光照強(qiáng)度75 μmol·m-2·s-1),然后在解剖鏡下統(tǒng)計(jì)侵染結(jié)果。(5)藻枝體尖端白化的相對風(fēng)險(xiǎn)的計(jì)算公式:白化的相對風(fēng)險(xiǎn)R=(實(shí)驗(yàn)組白化的個(gè)數(shù)/實(shí)驗(yàn)組健康的個(gè)數(shù))/(對照組白化的個(gè)數(shù)/對照組健康的個(gè)數(shù))。并使用卡方檢驗(yàn)來進(jìn)行差異顯著性分析,設(shè)R>1且p≤0.05的為條件致病菌,R<1且p≤0.05的則為保護(hù)性菌株,其余為中性菌。

2 結(jié)果

2.1 真江蘺表面附生細(xì)菌分類學(xué)鑒定

本文作者共分離出79株菌株,從Nt組和Ht組中分別分離出44和35株菌株。經(jīng)16SrRNA基因全長序列比對可知:這些菌株隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)或變形菌門(Proteobacteria)(見表1);67 %的菌株屬于厚壁菌門芽孢桿菌綱(Bacilli)中的腸球菌屬(Enterococcus)(51株)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)(1株)和Mammaliicoccus(1株)3個(gè)屬;33 %的菌株屬于變形菌門γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)弧菌屬(Vibrio)(26株菌株)。

表1 真江蘺可培養(yǎng)附生細(xì)菌的分類學(xué)鑒定Table 1 Taxonomic identification of the isolated epibacterial strains from G. vermiculophylla

將所有菌株的16SrRNA基因全長序列與EziBioCloud基因數(shù)據(jù)庫對比,將相似度高于98.65%的菌株視為同種菌株[18]。結(jié)果表明:Nt組的44株菌株被鑒定為來自5種細(xì)菌,分別是糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、墨西哥微小桿菌(Exiguobacteriummexicanum)、松鼠葡萄球菌(Mammaliicoccussciuri)、新喀里多尼亞弧菌(Vibrioneocaledonicus)和相模原弧菌(Vibriosagamiensis),其中糞腸球菌的占比最高,為68%(見圖1a);Ht組的35株細(xì)菌被鑒定為來自4種細(xì)菌,分別為糞腸球菌、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、新喀里多尼亞弧菌和相模原弧菌,其中糞腸球菌在Ht組的占比也是最高的,為60%(見圖1b)。有趣的是,在Ht組的樣本中未分離出墨西哥微小桿菌和M.sciuri。同樣,在Nt組的樣本中也未發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌。

((a) Nt組不同可培養(yǎng)菌株的占比Proportion of different isolated bacterial strains in Nt group;(b) Ht組不同可培養(yǎng)菌株的占比Proportion of different isolated bacterial strains in Ht group。)圖1 Nt組和Ht組不同可培養(yǎng)菌株的占比Fig.1 Proportion of different bacterial strains in Nt and Ht groups

2.2 16S rRNA 基因序列分析

編號(hào)為Nt2-2、Ht4-5、Nt6-4、Ht9-6、Nt11-1和1/2Ht12-4的分離菌株同EziBioCloud基因數(shù)據(jù)庫中已知標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA基因序列的相似性均小于98.65%,故推斷這些未知菌株可能為新種。本研究以AkkermansiaglycaniphilaPytT為外群菌株,對序列比對相似性小于98.65%的菌株構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖2)。其中菌株Nt2-2和1/2Ht 12-4 二者的16SrRNA基因序列同腸球菌屬的糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株EnterococcusfaecalisATCC 19433T的16SrRNA基因序列的相似性分別為98.25%和98.56%。菌株Ht4-5、Ht9-6和Nt11-1三者的16SrRNA基因序列同弧菌屬的相模原弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株VibriosagamiensisLC2-047T的16SrRNA基因序列的相似性分別為98.23%、98.61%和98.31%。而菌株Nt6-4的16SrRNA基因序列同Mammaliicoccus屬的M.sciuriDSM 20345T的16SrRNA基因序列的相似性為98.47%。由圖2可見,Nt2-2和1/2 Ht12-4、Ht9-6和Nt11-1在進(jìn)化樹中均為獨(dú)立分支,說明這些菌株可能是真江蘺表面附生細(xì)菌中新的未鑒定的菌株。

(菌株名稱后括號(hào)內(nèi)的序號(hào)為NCBI序列編號(hào);分支點(diǎn)上數(shù)字為重復(fù)1 000次的自展值;標(biāo)尺0.10為核苷酸替換率。NCBI accession numbers were listed behind strain numbers in parentheses,numbers at nodes indicate percentage levels of bootstrap support based on a Neighbor-Joining analysis of 1 000 resampled datasets,bar = 0.10 indicates 0.10 substitutions per nucleotide position.)圖2 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的新種NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 A neighbor-joining phylogenetic tree of new species based on the 16S rRNA gene sequences

2.3 侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后,添加保護(hù)性菌株的真江蘺藻枝體未出現(xiàn)白化的現(xiàn)象(見圖3a),添加條件致病菌的樣本則出現(xiàn)了藻枝體尖端白化現(xiàn)象(見圖3b和c)。由表2可知:Nt組中,相模原弧菌是保護(hù)性菌株(R<1且p≤0.05),新喀里多尼亞弧菌和糞腸球菌均是條件致病菌(R>1,p≤ 0.05);而Ht組中,相模原弧菌也是保護(hù)性菌株,條件致病菌包括新喀里多尼亞弧菌、糞腸球菌和溶藻弧菌(R=4.474,P=0.005)。

(a:健康藻枝體Healthy thallus tip;b和c:雌和雄白化藻枝體Bleaching thallus tip。黑色箭頭所指的方向?yàn)槌霈F(xiàn)白化病癥的部位Black arrows indicating the bleaching symptom。)圖3 真江蘺藻枝體尖端白化病癥的特征Fig.3 Characteristics of tips bleaching in G. vermiculophylla

表2 入侵種真江蘺保護(hù)性細(xì)菌和條件致病菌Table 2 Protective bacteria and opportunistic pathogenic bacteria isolated from G. vermiculophylla

3 討論

本文運(yùn)用傳統(tǒng)微生物學(xué)培養(yǎng)的方法從常溫和高于正常海水溫度3 ℃的處理?xiàng)l件下共分離、純化79株可培養(yǎng)細(xì)菌。經(jīng)16SrRNA基因序列同源性分析后,將它們鑒定為6種細(xì)菌,分別是糞腸球菌、墨西哥微小桿菌、松鼠葡萄球菌、溶藻弧菌、新喀里多尼亞弧菌和相模原弧菌。侵染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,相模原弧菌是保護(hù)性細(xì)菌,而糞腸球菌、溶藻弧菌和新喀里多尼亞弧菌均是條件致病菌。

Saha等[9]通過宏基因組學(xué)方法,研究了入侵種真江蘺表面附生細(xì)菌群落的組成與多樣性,結(jié)果表明,真江蘺的表面附生細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門和變形菌門。本研究中分離的79株菌株中有67%隸屬于厚壁菌門,33%隸屬于變形菌門支持了該觀點(diǎn)。厚壁菌門和變形菌門均是不同發(fā)育時(shí)期海帶表面附生細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌門[20],這說明許多大型海藻上有共同門水平的表面附生細(xì)菌群落[1]。厚壁菌門的成員可以抵抗多種環(huán)境壓力的影響,擁有高效的能量生成系統(tǒng)[2],厚壁菌門的相對豐度較高,這可能與真江蘺具有較強(qiáng)的抗逆性有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn):在Nt組和Ht組中糞腸球菌、新喀里多尼亞弧菌和相模原弧菌都是優(yōu)勢菌屬,這可能是由于入侵種真江蘺對溫度脅迫具有較高的抗性,可在5～30 ℃的環(huán)境下存活[21-22],高于正常海水溫度3 ℃的條件下對真江蘺表面附生細(xì)菌群落的影響較小,甚至沒有造成影響;糞腸球菌、新喀里多尼亞弧菌和相模原弧菌可能都同真江蘺建立了緊密的關(guān)系,屬于真江蘺的藻際微生物,在藻際微環(huán)境中真江籬的分泌物為這3種菌提供了其偏好的有機(jī)營養(yǎng),由于環(huán)境溫度的變化對海藻分泌物的影響不大,因此這3種菌的優(yōu)勢地位未發(fā)生改變[1]。

Saha和Weinberger[15]發(fā)現(xiàn)真江蘺表面附生細(xì)菌中存在著一些保護(hù)性細(xì)菌,能夠降低條件致病菌導(dǎo)致的藻枝體尖端白化的風(fēng)險(xiǎn)。這種保護(hù)性細(xì)菌不僅存在于其他江蘺屬的海藻中[23],也存在于紅藻D.pulchra[24]、珊瑚[25]以及墨角藻中[26]。本文中,相模原弧菌是能夠抑制真江蘺出現(xiàn)白化病癥的保護(hù)性菌株。相模原弧菌最初是由Yoshizawa等[27]從日本相模灣和赤道地區(qū)的海水中分離出來。相模原弧菌為革蘭氏陰性菌,呈桿狀,單極鞭毛且能夠移動(dòng),能夠在10～37 ℃的條件下于0.5%～6%的NaCl溶液(最適濃度為3%～5%)中生長,標(biāo)準(zhǔn)菌株為V.sagamiensisLC2-047T。目前,有關(guān)該菌的相關(guān)研究還很少,因此其對海藻宿主的保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

在本研究中,糞腸球菌、溶藻弧菌和新喀里多尼亞弧菌是能夠引起真江蘺出現(xiàn)白化病癥的條件致病菌。糞腸球菌廣泛分布于自然界的各種環(huán)境中,包括土壤、地表水、植物以及恒溫動(dòng)物(包括人類的)胃腸道中[28]。腸球菌屬的細(xì)菌能夠耐受各種環(huán)境壓力和惡劣環(huán)境,包括極端溫度(小于5 ℃或大于65 ℃)、極端pH(小于4.5或大于10.0)和高鹽環(huán)境中,使它們能夠在廣泛的生態(tài)位中定殖[29]。Enterococcus屬的物種在過去被認(rèn)為是對人類無害的,因此其被廣泛當(dāng)作食品工業(yè)中的發(fā)酵劑或被視為益生菌[30]。最近,Enterococci已成為最常見的醫(yī)院病原體之一,患者死亡率高達(dá)61%[31]。本研究的結(jié)果表明,腸球菌屬的一些物種不僅是人類致病菌,也可能是海藻的條件致病菌?；【鷮俚囊恍┘?xì)菌如創(chuàng)傷弧菌[32]、副溶血性弧菌[3]、霍亂弧菌[33]分別是紫菜、海帶和江蘺的條件致病菌。同前人的研究結(jié)果一致,本研究也發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌和新喀里多尼亞弧菌也是引起真江蘺白化病癥的條件致病菌。溶藻弧菌是一種生活在海洋和河口環(huán)境中的嗜鹽細(xì)菌,也是引起人類疾病的十幾種弧菌屬的細(xì)菌之一,可導(dǎo)致嚴(yán)重的軟組織感染、敗血癥和腸道感染[34]。溶藻弧菌還是南美對蝦、蛤蜊、鰻鱺等水產(chǎn)動(dòng)物的致病菌[35-36]。新喀里多尼亞弧菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株為V.neocaledonicusNC470T,菌落呈圓形,乳黃色,菌落大小為2～3 mm,是一種潛在的降解有機(jī)污染物的細(xì)菌[37]。王印庚等[38]報(bào)道新喀里多尼亞弧菌可能是凡納濱對蝦苗細(xì)菌性?；Y的條件致病菌之一。

Bonthond等[39]利用16SrRNA基因高通量測序技術(shù),發(fā)現(xiàn)全球尺度下的入侵種真江蘺表面附生細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌屬為獨(dú)島菌屬(Dokdonia)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)和弧菌屬等。但在本研究分離、鑒定細(xì)菌的結(jié)果中,除了弧菌屬,未見其他優(yōu)勢菌屬的菌株。這可能是因?yàn)槲⑸锱囵B(yǎng)方法僅能分離只有1%左右的海洋微生物[40]。因此,傳統(tǒng)的微生物學(xué)培養(yǎng)方法有很大的局限性。需要建立新的培養(yǎng)方法或研制出新的培養(yǎng)基,才有可能把16SrRNA基因高通量測序測出的優(yōu)勢菌分離出來。16SrRNA基因高通量測序鑒定出的潛在致病菌需通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)侵染實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證,以確定其是否為真正的致病菌。

4 結(jié)語

本研究中,通過利用德國基爾Helmhotlz海洋研究中心的Benthocosm系統(tǒng)、傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法及侵染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),海水溫度升高3 ℃可影響入侵種真江蘺表面附生細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu),還可能增加真江蘺的患病幾率。本文篩選、鑒定的保護(hù)性細(xì)菌與條件致病菌不僅豐富了入侵海藻真江蘺表面附生細(xì)菌相關(guān)知識(shí)的體系,同時(shí)為防控真江蘺白化病的爆發(fā)提供了技術(shù)支撐。未來仍需對條件致病菌的致病機(jī)理和保護(hù)性菌株的功能進(jìn)行深入研究。