海洋沉積物中揮發性脂肪酸的測定方法優化及在膠州灣海域的應用?

岳書香,莊光超,趙 敏,楊桂朋

(1. 中國海洋大學 深海圈層與地球系統前沿科學中心和海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室,山東 青島 266100; 2. 嶗山實驗室 海洋生態與環境科學功能實驗室,山東 青島 266237; 3. 中國海洋大學 化學化工學院,山東 青島 266100)

海洋占據地球表面約71%的面積,是地球上最大的生態系統。海洋沉積物中埋藏著大量的微生物,其生物量與整個海洋水體中的生物量相當[1]。作為沉積物中微生物的重要能量來源,揮發性脂肪酸(VFAs)是海洋沉積物中厭氧代謝和有機質降解的關鍵化合物,是生物大分子與最終再礦化產物甲烷和二氧化碳的重要中間產物[2]。

圖1 乙酸作為海洋沉積物碳循環中心示意圖[10]Fig. 1 Schematic representation of acetate as a centre of carbon cycling in marine sediments[10]

孔隙水中的VFAs濃度決定了沉積物微生物群落特定代謝過程的能量可用性[11-13],測定沉積物中的VFAs濃度及其深度剖面,有助于解釋沉積物中相關微生物過程的分布特征、控制因素及能量代謝途徑[14-16]。此前已有許多方法可用于測定沉積物孔隙水中VFAs濃度,但都有一定的局限性。表1總結了已有的測定沉積物孔隙水中VFAs的方法,以及每種方法測定的VFAs種類、檢出限及其優缺點。Parkes和Taylor[17]在1983年采用離子色譜電導率檢測方法對海洋沉積物孔隙水中的有機酸進行了分析,該方法需要先通過真空蒸餾將樣品中的有機酸與無機鹽分離,乙酸和丙酸的檢出限為1～2 μmol/L,但不能對甲酸、丁酸及戊酸進行定量分析。King[18]使用酶法對孔隙水中乙酸鹽濃度進行了測定,檢出限可達100 nmol/L,但該方法不能用于測定其他有機酸。Yang等[19]利用靜態擴散池將海水中的有機酸進行預濃縮,然后使用氣相色譜法對乙酸進行定量分析,該方法的檢出限為低納摩爾范圍內。Mueller-Harvey和Parkes[20]使用衍生化方法對海洋沉積物孔隙水進行了前處理,使用HPLC對C2—C5有機酸進行了測定,檢出限為0.5 μmol/L,但由于存在干擾峰,該方法不能對乙酸鹽進行定量分析。此外,Vairavamurthy和Mopper[21]使用衍生化方法對孔隙水樣品進行前處理,隨后使用氣相色譜結合氮選擇性檢測器對衍生化后的物質進行分析,檢出限為亞微摩爾。相比之下,Albert和Martens[22]利用高效液相色譜測定孔隙水中VFAs的方法,可用于分析C1—C5范圍內的VFAs,且有較高的靈敏度和較低的檢出限。該方法能夠滿足測定海洋沉積物孔隙水中VFAs濃度的需求,本文通過方法優化和改進,建立衍生化結合液相色譜儀對海洋沉積物孔隙水中VFAs的測定方法,并使用此方法對膠州灣沉積物孔隙水中的VFAs進行了測定。

表1 沉積物孔隙水中VFAs的測定方法、種類、檢出限及優缺點Table 1 Determination methods,types,detection limits,advantages and disadvantages of VFAs in sediment porewater

1 儀器試劑與色譜條件

1.1 主要儀器與試劑

島津LC-16P制備液相色譜儀(日本島津公司)。SPD-16紫外可見檢測器(日本島津公司)。H1750R高速冷凍離心機(湖南湘儀公司)。XDB-C8分析色譜柱(美國安捷倫公司)。PRP-1 HPLC保護柱(瑞士Hamilton公司)。

乳酸鈉溶液(60%)、甲酸鈉(99%)、乙酸鈉(99%)、丙酸鈉(99%)、正丁醇(99.7%,色譜純)、四丁基氫氧化銨(40%)、溴化十四烷基三甲基銨(99%)、2-硝基苯肼(97%)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、吡啶(99.8%)、磷酸(85%,色譜純),以上試劑均經上海sigma公司購買。鹽酸(優級純,南京化學試劑有限公司)、KOH(85%,國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 色譜分析

流動相A和B成分相似,1 L流動相A主要包括2.5%正丁醇、50 mmol/L乙酸鈉、2 mmol/L 四丁基氫氧化銨(TBAOH)、2 mmol/L 溴化十四烷基三甲基銨(TDTMABr)和0.5 g硅膠,加入硅膠的主要目的是保護色譜柱填料。溶液混合均勻后用磷酸調節pH至4.5。流動相B和A的區別在于B中TDTMABr的濃度為50 mmol/L,其他物質濃度均一致。流動相需用0.45 μm聚醚砜濾膜過濾。

液相配備0.5 mL定量環,進樣方式為手動進樣,為了確保將定量環中的液體全部置換,需要用注射器吸取1.5～2 mL的樣品(將定量環中的液體全部置換需要至少三倍定量環體積的樣品)。紫外檢測器設定波長為400 nm。液相色譜中流速可影響色譜峰的分離、峰型和保留時間,Agilent XDB-C8反相液相色譜柱的最佳流速為1 mL/min。為了保持色譜柱的最佳性能,將流速設定為1 mL/min。經過大量實驗,最終設定的洗脫程序如表2所示。流動相由初始100% A在5 min內逐漸過渡至100% B,持續25 min,在1 min內由100% B過渡為100% A,持續14 min,分析總時間為45 min。

表2 洗脫程序Table 2 Elution Procedure

2 衍生化方法優化及評價

2.1 衍生化方法

因VFAs本身無紫外吸收,標準溶液和樣品中的VFAs需經過衍生化處理才能實現對其定量檢測的目的。在水溶液中,有機酸可與2-硝基苯肼(NPH)偶聯生成2-硝基苯肼衍生物,這些衍生物可與甲醇-水或乙腈-水溶劑體系分離,并能在可見光400 nm波長處被檢測到。因此,本實驗使用NPH作為衍生化試劑,紫外檢測器吸收波長設定為400 nm。

此外,pH是衍生化成功的一個重要條件。在衍生化之前,加入吡啶-鹽酸緩沖溶液使樣品的pH控制在3.5～5范圍內。在此pH范圍內,溶液衍生化后的顏色為橙紅色,表明衍生化過程成功。若衍生化后的樣品顏色為橙黃色,表明溶液pH偏低,衍生化失敗。樣品中的CO2會影響衍生化過程中的pH,導致樣品衍生化失敗。此外,NPH可將CO2衍生化,產生一種不穩定的衍生物,與有機酸的色譜峰共洗脫。為保證樣品衍生化成功,在加入吡啶-鹽酸緩沖溶液后使用N2吹掃4～5 min即可消除CO2的影響。

樣品的前處理步驟如下:

(1)配制吡啶-鹽酸比例為1∶1的緩沖溶液,在2 mL水樣中添加0.2 mL吡啶-鹽酸緩沖液(添加試劑體積為樣品體積的10%),混合后用N2吹掃4～5 min。

(2)配制 0.1 mol/L NPH的鹽酸溶液,鹽酸濃度為0.25 mol/L。添加0.2 mL該溶液于水樣中,渦旋混合。

(3)配制0.3 mol/L EDC溶液,添加0.2 mL EDC溶液,渦旋混合。

分析可知，上游壩坡坡腳采用砂巖壓重處理后，5種工況下大壩上游壩坡的安全系數增大明顯，壩體穩定性顯著提高，均滿足規范要求。本工程在加固前上游壩坡在正常蓄水位、設計洪水位、校核洪水位、校核洪水位降至正常蓄水位和正常蓄水位情況下，驟降至死水位時，安全系數分別為1.19，1.20，1.23，1.14，0.98；而采用砂巖壓重處理后5種工況對應的上游壩坡安全系數分別增加到1.41，1.53，1.58，1.47，1.27。說明除險加固設計采用的砂巖壓重措施效果十分顯著。

(4)將上述樣品置于黑暗處衍生化1.5 h。

(5)配制6 mol/L HCl溶液,添加0.2 mL該溶液于樣品中,渦旋混合。

(6)1 min后,添加0.2 mL 40% KOH(w/v)溶液,渦旋混合。

(7)70 ℃水浴加熱10 min后,冷卻、離心,取上清液進行液相分析。離心機的溫度、轉速和時間分別設置為25 ℃、5 000 r·min-1和5 min。

為保證衍生化方法的準確性,對衍生化方法進行了優化,步驟(5)為實驗優化后添加的步驟,具體優化過程見2.2.1。

2.2 方法優化

2.2.1 標準曲線線性優化 實驗過程中使用Milli Q水配制標準溶液,標準溶液進行衍生化處理后可上機測定并繪制標準曲線。經液相測定,乙酸鹽的標準曲線并沒有良好的線性。經過多次實驗,排除了人為的操作污染,可能是衍生化試劑導致。為保證標準溶液和樣品衍生化完全,加入的衍生化試劑是遠遠過量的。而流動相A和B中均含有50 mmol/L的乙酸鈉,樣品中未反應完全的衍生化試劑可將流動相中的乙酸鈉衍生化,造成一個不穩定的空白峰面積。在衍生化過程結束后加入0.2 mL 6 mol/L的鹽酸溶液可使EDC試劑失活,從而避免衍生化試劑將流動相中的乙酸鈉衍生化。為探究未反應完全的衍生化試劑是否會對標準曲線的線性造成影響,設計了相關的對照實驗。以未在衍生化結束后加入鹽酸溶液的標準溶液作為對照組,加入鹽酸后的標準溶液作為實驗組。對照組和實驗組中不同濃度下乙酸的峰面積如表3所示。

表3 對照組和實驗組中不同濃度下乙酸鹽的峰面積Table 3 Peak areas of acetate at different concentrations in the control and experimental groups

實驗組中乙酸鹽的空白峰面積降低了30.6%,表明流動相中的乙酸鈉能夠與衍生化試劑發生反應。為探究加入鹽酸對改進標準曲線的線性是否有效,對以上兩組實驗繪制了線性圖表,標準曲線如圖2所示。

圖2 對照組和實驗組的標準曲線Fig.2 Standard curves for control and experimental groups

實驗組的標準曲線線性較好,線性相關系數為0.996 8,而對照組的線性相關系數為0.973 3,標準曲線線性較差。為避免實驗的偶然性,重復7次實驗,線性相關系數分別為0.992 1、0.997 3、0.989 6、0.992 4、0.997 8、0.994 5和0.995 1,平均值為0.994 1。表明在衍生化過程結束后加入鹽酸可改進標準曲線的線性,線性相關系數大都在0.99以上。因此,為保證標準曲線的良好線性,在衍生化過程結束后,需要加入0.2 mL 6 mol/L的鹽酸溶液。

此外,加入鹽酸也能降低乙酸鹽的空白峰面積。此時乙酸鹽的檢出限為5 μmol/L,而沉積物孔隙水中乙酸鹽的濃度為微摩爾級別,該檢出限并不能滿足沉積物孔隙水中乙酸鹽濃度的測定。如何降低乙酸鹽的空白成為了需要重點解決的問題。

2.2.2 乙酸鹽的空白優化 衍生化過程中加入的試劑種類繁多,可能增加乙酸鹽的空白峰面積。于Sigma公司購買的NPH試劑含有較多雜質,用于配制溶液時并不能完全溶解,需要進行純化。采用冷凍干燥的方式對NPH進行純化,冷凍干燥的具體步驟為:將NPH粉末充分溶解在70 ℃水中,過濾掉不溶的雜質,將得到的濾液進行冷凍,待濾液冷凍完全后放入冷凍干燥機進行冷凍干燥,24 h即可。冷凍干燥后得到的NPH粉末用于配制溶液時即可完全溶解。此外,高純度吡啶試劑中的有機酸污染比較嚴重,因此需要對吡啶進行蒸餾純化。吡啶沸點為115.2 ℃,蒸餾時取115 ℃左右的餾分。為探究以上實驗是否能夠降低乙酸鹽的空白峰面積,將純化后的NPH和吡啶均用于配制試劑,得到的乙酸鹽標準曲線如圖3所示。

圖3 乙酸鹽的標準曲線Fig.3 A standard curve for acetate

使用純化后的試劑配制溶液,乙酸鹽的空白峰面積降低了62.0%,同時標準曲線的線性也得到了提升,線性相關系數為0.999 2,高于0.999。后續進行多次實驗,標準曲線的線性相關系數均高于0.999,表明以上的優化過程是有效的。此時乙酸鹽的檢出限降低至原來的十分之一,為0.5 μmol/L。

2.3 方法評價

對乳酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽和丙酸鹽的混合標準溶液經衍生化處理并進行液相分析,最終得到的四種VFAs標準色譜圖如圖4所示。

圖4 四種VFAs的液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatogram of four VFAs

色譜峰洗脫先后順序為乳酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽和丙酸鹽,保留時間分別為9.6、10.8、11.9和13.6 min。

配制一定梯度的甲酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉和乳酸鈉混合標準溶液,得到的各VFAs標準曲線線性相關系數均需大于0.999。配制1 μmol/L的標準溶液,對標準溶液進行衍生化處理,按照具體色譜條件進行分析,當日平行進樣7次,記錄峰面積,計算精密度 (RSD)。實驗得到的乳酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽和丙酸鹽的保留時間、回歸方程、線性相關系數、檢出限和精密度等如表4所示。

表4 乳酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽的保留時間、回歸方程、檢出限和精密度Table 4 Retention time,regression equation,detection limits,and precision of lactate,formate,acetate and propionate

四種VFAs的標準曲線線性良好,線性相關系數均大于0.999,精密度均在10%以內,有較好的重現性。這四種物質中,乳酸鹽的空白峰面積小,檢出限最低,為0.2 μmol/L。而乙酸鹽的空白峰面積在經過實驗優化和試劑純化后仍不可忽略,實驗中得到的最低檢出限為0.5 μmol/L。丙酸鹽的空白較低,其檢出限可達0.3 μmol/L。甲酸鹽的重現性好,且空白低,檢出限為0.3 μmol/L。在Albert和Martens[22]的方法中,乳酸鹽、乙酸鹽和甲酸鹽的精密度分別為3.8%、1.3%和1.9%,檢出限為低納摩爾范圍(由于空白的不確定性,最低約為500 nmol/L),沒有對丙酸鹽的精密度和檢出限進行探究。優化后的方法具有較高的精密度和較低的檢出限,可用于海洋沉積物孔隙水VFAs濃度的測定。

3 方法應用

膠州灣位于山東省青島市內,是一個半封閉海灣,面積為320 km2,是中國較大的優良港灣。于2020年12月27日前往膠州灣大沽河口進行了沉積物采樣工作,該區域內的優勢植被為互花米草。A取樣點位于大沽河河口潮間帶地區(36.28°N,120.22°E),如圖5所示。采樣點處于河口區,沉積速率較快,有機質相對新鮮且易降解。選取采樣點A的四個采樣站位進行采樣,獲得的沉積物是典型的潮間帶沉積物,使用Rhizon采樣器抽取孔隙水進行測定分析。

利用以上的操作方法,對膠州灣的部分孔隙水樣品的VFAs進行測定,孔隙水在進行實驗前需用0.22 μm聚醚砜濾膜過濾,按照上述實驗步驟進行衍生化處理,經衍生化后的樣品用注射器吸取注入液相色譜進行分析,樣品的液相色譜圖如圖6所示。

圖6 樣品的液相色譜圖Fig.6 Liquid chromatogram of the sample

孔隙水樣品的色譜圖中存在較多雜峰,但不會對目標色譜峰造成影響,且乳酸鹽、乙酸鹽和甲酸鹽的保留時間與標準相似。此外,實驗測得的數據如表5所示。

表5 膠州灣地區部分樣品的甲酸鹽和乙酸鹽濃度數據Table 5 Formate and acetate concentration data of some samples in the Jiaozhou Bay area

由表5可知,膠州灣沉積物孔隙水中主要檢測到乙酸鹽和甲酸鹽,且乙酸鹽濃度均高于甲酸鹽濃度。乙酸鹽的濃度變化范圍為2.2～17.4 μmol/L,均高于檢出限,且乙酸鹽的精密度為1.9%,可以滿足測定膠州灣河口沉積物孔隙水中乙酸鹽濃度的測定要求。甲酸鹽濃度的變化范圍為0.4～6.5 μmol/L,其中三個樣品的甲酸鹽濃度低于檢出限(0.3 μmol/L),甲酸鹽的精密度為1.2%,表明該方法可滿足該區域多數孔隙水樣品中甲酸鹽濃度的測定。

沉積物孔隙水中乙酸鹽的濃度反映了生物生產及消耗作用的平衡。生物生成乙酸鹽的途徑主要是厭氧發酵及產乙酸菌利用CO2和H2自養產乙酸。乙酸鹽濃度受產乙酸菌、產甲烷菌、硫酸鹽還原菌、反硝化菌和鐵錳還原菌等多種微生物控制。不同站位沉積物中乙酸鹽的濃度有差異,主要受硫酸鹽還原過程、甲烷產生過程和硝酸鹽還原過程和鐵錳還原過程的影響。

該區域乙酸鹽表層低底層高的分布特征表明表層沉積物中有足夠的的電子受體,乙酸鹽被微生物迅速消耗,保持在較低的水平。而隨著深度的增加,乙酸鹽的生成過程超過消耗過程,導致乙酸鹽的積累。而甲酸鹽主要來源于有機質發酵過程,不同站位的有機質發酵速率不同,導致了甲酸鹽的濃度差異。

4 結語

本文對衍生化結合液相色譜測定海洋沉積物孔隙水中VFAs的方法進行了優化,通過加入鹽酸和純化衍生化試劑,改善了標準曲線的線性,降低了乙酸鹽的檢出限。四種VFAs的線性相關系數均高于0.999,乙酸鹽的檢出限由5 μmol/L降低至0.5 μmol/L,乳酸鹽、甲酸鹽和丙酸鹽的檢出限分別為0.2、0.3和0.3 μmol/L。使用此方法對膠州灣沉積物孔隙水中的VFAs進行了測定,乙酸鹽的濃度變化范圍為2.2～17.4 μmol/L,甲酸鹽的濃度變化范圍為0.4～6.5 μmol/L,乙酸鹽濃度均高于甲酸鹽濃度。此方法具有較高的靈敏度和較低的檢出限,可用于海洋沉積物孔隙水中VFAs的濃度測定。