枸杞提取物中玉米黃質和葉黃素含量的高效液相測定方法

唐 瑗，康 瑤，於洪建，張東星

1.天津中醫藥大學 天津 301617；2.天津益倍生物科技集團有限公司 天津 300457

枸杞是一種傳統的藥食同源藥材［1］，尤其利于明目，俗稱“明眼子”，其主要活性成分枸杞色素和枸杞多糖［2］具有多種功效，如免疫調節、抗炎、神經保護、護肝護眼、抗氧化［3-4］。枸杞色素主要由游離型類胡蘿卜素、類胡蘿卜素酯化衍生物和類胡蘿卜素糖基化衍生物組成［5］，游離類胡蘿卜素含有葉黃素、新黃質、玉米黃質和隱黃質等［6］。由于枸杞富含類胡蘿卜素，所以常被用于開發護眼健康食品，在年齡相關性眼病研究中，玉米黃質和葉黃素代替β-胡蘿卜素成為明目的主要功效性成分［7］。因此，枸杞提取物中葉黃素和玉米黃質分離檢測方法的開發，對于研發含有枸杞的明目健康食品具有重要意義。

葉黃素和玉米黃質具有相同的分子式，即C40H56O2，屬于同分異構體。目前，高效液相色譜法是葉黃素和玉米黃質最常用的檢測方法，用于兩者分離的固定相也有多種選擇，如硅膠、C18、C30 等。在相關文獻中，有研究者運用正相硅膠色譜柱對葉黃素和玉米黃質進行了分離檢測，二者都能夠實現基線分離［8-9］；還有研究者使用C30 色譜柱對葉黃素和玉米黃質進行了分離檢測，二者皆可被鑒定［10-15］；此外，還有研究者運用C18 色譜柱對葉黃素和玉米黃質進行了分離檢測［16-19］。但對于枸杞中葉黃素和玉米黃質的分離檢測，更多使用C30 色譜柱，流動相的選擇也較為復雜，最常使用二氯甲烷和甲基叔丁基醚作為改性劑。雖然使用C30 色譜柱可以更好地分離葉黃素和玉米黃質，但由于C30 柱價格更高，流動相毒性較大，不利于常規的普及性檢測。相比之下，C18 色譜柱是一種常用的固定相，使用C18 色譜柱來建立玉米黃質與葉黃素同時快速測定方法對于枸杞提取物質量控制具有重要意義。同時，該方法的建立有助于推廣和普及對葉黃素和玉米黃質的快速測定技術，能夠促進具有明目功效的枸杞產品的質量控制研究。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

枸杞提取物（批號：20221001、20221003、20221006、20220417），無錫市世紀生物有限公司；無水乙醇（分析純），天津市康科德科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），天津市康科德科技有限公司；玉米黃質標準品（HPLC≥98%），北京倍特仁康生物醫藥科技有限公司；葉黃素標準品（HPLC ≥98%），北京倍特仁康生物醫藥科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀E2695，沃特世有限公司；超聲波清洗器（KQ-500V型），昆山市超聲儀器有限公司；臺式低速自動平衡離心機（TDZ4-WS），湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；旋渦混合器（GL-88B），海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平（十萬分之一），Mettler-Toledo MS105DU；色譜柱，Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液的配制

精確稱取玉米黃質和葉黃素標準品2 mg，分別置于100 mL的棕色容量瓶中，用無水乙醇定容，并作為母液，分別移取標準儲備液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL置于10 mL的容量瓶中；用無水乙醇定容，分別得到不同濃度提取的玉米黃質標準品溶液和葉黃素標準品溶液。

1.3.2 供試品溶液的配制

精確稱取樣品125 mg，置于離心管中，加入無水乙醇適量，用旋渦混合器振蕩，超聲10 min，以4 000 r/min離心10 min；重復上述操作至無色，將上清液轉移至25 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，將其作為供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

經優化，確定最佳色譜條件為：色譜柱，Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.05%三乙胺-乙腈；流速0.8 mL/min；檢測波長450 nm；柱溫28 ℃；進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

玉米黃質和葉黃素均易溶于有機溶劑，如甲醇、乙腈、無水乙醇、丙酮、二氯甲烷等［20］，故分別選用甲醇、乙腈、乙醇3種常用溶劑對葉黃素和玉米黃質標準品進行溶解。葉黃素與玉米黃質在甲醇或乙醇中的溶解度優于乙腈，鑒于甲醇的毒性比乙醇大，且價格高于乙醇，相比之下，選擇毒性最小、價格低的乙醇作為提取溶劑。

2.2 流動相的選擇

在查閱參考文獻的基礎上，比較乙腈-甲醇［21-22］、乙腈和乙腈-二氯甲烷［23］3種流動相體系。在乙腈-甲醇流動相中，隨著乙腈比例的增加，出峰時間延長，葉黃素與玉米黃質逐漸分離，但未實現基線分離；在乙腈-二氯甲烷（9:1）流動相中，葉黃素與玉米黃質不能很好地分離；在乙腈流動相中，葉黃素和玉米黃質的分離度良好，但隨著葉黃素和玉米黃質濃度的增加，存在拖尾現象。故選擇純乙腈作為流動相，為改善拖尾現象，加入0.05%三乙胺，從而獲得良好的峰形與分離度。葉黃素、玉米黃質及其混合標準色譜圖分別見圖1～3，樣品見圖4。

圖1 葉黃素標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of lutein standard

圖2 玉米黃質標準品色譜圖Fig.2 Chromatogram of zeaxanthin standard

圖3 葉黃素和玉米黃質標準品色譜圖（色譜柱Innoval ODS-2）Fig.3 Chromatogram of lutein and zeaxanthin standard

圖4 樣品色譜圖（色譜柱Innoval ODS-2）Fig.4 Chromatogram of sample

2.3 檢測波長的選擇

取葉黃素和玉米黃質標準溶液分別于200～500 nm處進行波長掃描，結果見圖5 ~ 6，葉黃素于447 nm處有最大吸收峰，玉米黃質于453 nm處有最大吸收峰，綜合掃描結果，選擇450 nm為高效液相色譜檢測的測定波長。

圖5 葉黃素光譜圖Fig.5 Spectrum of lutein

圖6 玉米黃質光譜圖Fig.6 Spectrum of zeaxanthin

2.4 檢測方法驗證實驗

2.4.1 線性范圍和檢測限度

分別吸取1.3.1 中葉黃素和玉米黃質對照品溶液10 μL，記錄峰面積，以濃度X為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線，并進行回歸計算，獲得玉米黃質的線性回歸方程：

葉黃素的線性回歸方程

其中：Y為峰面積；X為玉米黃質/葉黃素質量濃度，μg/mL。

結果表明，玉米黃質和葉黃素分別在0.207～20.7 μg/mL和0.216～21.6 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。用無水乙醇將玉米黃質和葉黃素標準品溶液稀釋至一定濃度，記錄儀器信噪比（S/N）值，根據S/N≥3 時為儀器檢出限，得出玉米黃質的檢出限為0.027 μg/mL、葉黃素的檢出限為0.056 μg/mL。

2.4.2 精密度試驗

精確吸取2.07 μg/mL 玉米黃質對照品溶液、2.16 μg/mL葉黃素的對照品溶液各10 μL，按1.3.3 下色譜條件分別連續取樣6 次，記錄峰面積，得出玉米黃質的RSD值為0.47%、葉黃素的RSD為0.62%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗

精密吸取同一批供試品溶液，按1.3.3 下色譜條件，分別于0、2、4、6、12、24 h記錄玉米黃質和葉黃素的峰面積，得出玉米黃質的RSD值為1.38%、葉黃素的RSD值為4.45%。結果表明，在室溫條件下，玉米黃質和葉黃素放置24 h穩定性最好，但考慮到兩者抗氧化性和在光照條件下不穩定等因素，所以兩者應隨測隨配。

2.4.4 重復性試驗

取批號為20221004 的枸杞提取物6 份，按照上述溶液配制方法制備供試品溶液，在1.3.3 下的色譜條件取樣10 μL，記錄峰面積，利用標準曲線，測定葉黃素和玉米黃質的含量，得出葉黃素、玉米黃質的RSD值分別為0.96%、0.73%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗

精確稱取已知含量的枸杞提取物6 份，每份約26 mg，分別加入20.7 μg/mL的玉米黃質對照品溶液0.5 mL 和21.6 μg/mL 的葉黃素對照品溶液0.1 mL；按照上述溶液配制方法，制備供試品溶液，再按1.3.3下的色譜條件，計算回收率，得出玉米黃質平均回收率為113.72%、RSD值為1.50%、葉黃素平均回收率為105.96%、RSD 值為3.78%，結果見表1 ~ 2，加標回收率結果符合分析要求，試驗結果準確可靠。

表1 玉米黃質加樣回收率試驗考察結果Tab.1 Results of zeaxanthin spiked recovery test

表2 葉黃素加樣回收率試驗考察結果Tab.2 Results of lutein spiked recovery test

2.5 不同色譜柱的考察

選擇2 根載碳量不同的色譜柱，Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）與Durashell C18（L）（4.6 mm×250 mm，5 μm），載碳量分別為14%、17%，在相同的流動相0.05%三乙胺-乙腈、相同的檢測條件下，得到結果見圖3（色譜柱Innoval ODS-2）、圖7（色譜柱Durashell C18（L）），均可實現基線分離。

圖7 葉黃素和玉米黃質標準品色譜圖[色譜柱Durashell C18（L）]Fig.7 Chromatogram of lutein and zeaxanthin standard

2.6 樣品的含量測定

對4 批不同批號的枸杞提取物中玉米黃質和葉黃素進行含量測定，結果見表3。

表3 不同批次枸杞提取物中玉米黃質和葉黃素含量Tab.3 Contents of zeaxanthin and lutein in different batches of Lycium barbarum extract

3 結 語

本研究選用色譜柱Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.05%三乙胺-乙腈為流動相，建立了用高效液相快速準確檢測枸杞提取物中葉黃素和玉米黃質的方法。此方法所用流動相簡單，葉黃素和玉米黃質能夠實現基線分離，且峰形良好無明顯拖尾。標準樣品和待測樣品的測定結果表明，在所取濃度范圍內，葉黃素和玉米黃質均具有良好的線性關系，重復性、回收率等均滿足分析要求。