基于網絡藥理學分析羌活的藥理作用機制

萬亭君

(西南民族大學民族學博士后科研流動站,成都 610041;新華文軒出版傳媒股份有限公司博士后科研工作站,成都 610036)

0 引言

羌活NotopterygiuminchumTing ex H,T- Chang是一種傘形科植物的干燥根莖和根,又名護羌使者、羌青、胡王使者、退風使者等,在《中國藥典》中記載其味辛、苦,性溫,歸膀胱、腎經,具有解表散寒、祛風除濕、止痛的功效[1]。羌活傳統產區主要是藏族、羌族和其他少數民族聚居的高寒山區[2],是中、藏、羌醫藥體系常用藥物,具有悠久的藥用歷史和廣泛的應用范圍。現代藥理研究表明,羌活具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、解熱鎮痛等作用,對心腦血管系統、消化系統、呼吸系統和中樞神經系統有顯著影響[3]。網絡藥理學為中藥研究帶來了新的技術與方法,推進了藥物發現、開發和治療機制的理解過程,其系統性、整體性的研究理念與中藥復方多組分、多功效、協同作用等特點不謀而合,在中藥藥理機制研究、新藥發現及不良反應研究等方面取得了良好成效[4]。本研究為拓展羌活的現代藥理學內涵,選用網絡藥理學方法對其藥理成分進行篩選、分析,以期為更有針對性地深入探索其藥理機制奠定基礎。

1 研究方法

1.1 數據庫的選擇

中藥分子機制的生物信息學分析工具(BATMAN-TCM)、中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction、通用蛋白質知識庫(Uniprot)、String 11.5、DAVID 6.8生物信息學資源。

1.2 優效化合物的篩選

通過TCMSP檢索羌活的所有化學成分,設置化合物口服生物利用度(OB)閾值為≥30%,設定化合物類藥性(DL)閾值為≥0.18,獲得羌活的優效化合物。

1.3 化合物靶點的預測

將羌活的優效化合物分別輸入TCMSP、BATMAN-TCM、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction檢索成分靶點,合并、刪除重復靶點,再應用Uniprot數據庫轉換靶點蛋白名為基因名。

1.4 化合物-靶點網絡的構建

應用Cytoscape 3.9.1將篩選出的優效化合物和預測得到的靶點基因進行可視化呈現,構建化合物—靶點網絡。

1.5 蛋白質間相互作用(PPI)網絡的構建

在String 11.5數據庫中導入篩選所得的優效化合物對應的靶基因,設置最低相互作用分數要求為0.900,獲得靶點間的相互作用網絡,進一步應用CytoHubba分析獲得排名前10的核心基因。

1.6 基因本體論(GO)功能富集分析

將篩選出來的靶基因輸入DAVID數據庫進行GO功能富集分析。

2 結果

2.1 優效化合物的篩選

通過TCMSP檢索羌活的所有化學成分,共得到185個化學成分,閾值設定OB≥30%,DL≥0.18,結果共篩選出羌活優效化合物15個(表1)。

表1 羌活優效化合物篩選

2.2 化合物-靶點作用網絡的構建

通過TCMSP檢索獲得相關靶點,合并上述優效化合物輸入至BATMAN-TCM、STITCH、SwissTargetPrediction獲得的靶點,共檢索得到170個靶點蛋白,通過Uniprot數據庫轉換基因后應用Cytoscape 3.9.1構建化合物-靶點作用網絡(圖1)。圖中共有183個節點,包含13個化合物節點、170個靶點節點、246條連接線。圓形節點代表靶點,菱形節點代表化合物,連接線代表化合物-靶點的相互作用。圖中可見有多處同一靶點與不同化合物之間存在關聯,進一步印證了中藥多成分、多靶點的特點。

圖1 羌活優效化合物-靶點作用網絡Fig.1 Notopterygiuminchum compound-target action network

2.3 羌活靶點的PPI網絡構建與核心基因的獲得

以“置信分數≥0.900”作為條件構建羌活靶點PPI網絡圖(圖2)。圖中有128個節點、560條邊,其中節點表示靶點,邊表示靶點與靶點之間的相互作用關系。應用Cytoscape 3.9.1將數據進行可視化呈現,進一步采用MCODE模塊,以“score cutoff =0.2、 k core=2、 maximum depth = 100和degree cutoff=2”為條件進行聚類分析,共獲得9個子網絡,取分值最高的前5個聚類(圖3)。應用Cytohubba對網絡中的節點進行排名,通過MCC的拓撲學分析方法獲得排名前10的核心基因網絡(圖4)。

圖2 羌活優效化合物靶點PPI網絡Fig.2 Notopterygiuminchum compound target PPI network

圖3 聚類分值前5的子網絡Fig.3 Subnetworks of top 5 cluster

圖4 排名前10的核心基因網絡Fig.4 Top 10 core gene networks

圖3a～圖3e依次為分值降序的聚類子網絡。

2.4 羌活靶點的GO分析

將數據導入DAVID 6.8數據庫,對羌活靶點的生物過程、細胞成分和分子功能進行富集分析,按照顯著性程度P<0.01獲得了GO條目333條,靶點涉及的生物過程條目有200條,細胞成分43條,分子功能90條。其中,生物過程主要富集在對藥物的反應、外源代謝過程及對外源刺激的反應等;分子功能主要富集在RNA聚合酶II轉錄因子活性、配體活化序列特異性DNA結合、血紅素結合及細胞色素-c氧化酶活性等;細胞成分主要富集在線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ、線粒體和大分子復合體等。

3 討論

現代藥理學研究發現,羌活具有抗心律失常、抗腫瘤、抗缺血缺氧、抗血栓、調節中樞神經、抗氧化、抗炎、鎮痛、抗菌及抗病毒等作用[5]。為進一步闡釋羌活的藥理作用機制,利用網絡藥理學方法,基于篩選出的羌活的優效化合物構建化合物-靶點網絡和PPI網絡進一步對靶點進行基因本體的功能注釋,為羌活優效化合物的多靶點、多功效藥理作用機制提供研究基礎。

研究證實,香豆素糖苷、達萵瑟苷、羌活酚等香豆素類化合物是羌活發揮抗炎、抗氧化應激損傷等作用的有效成分[6]。羌活的甾體類化合物,如谷甾醇、β-谷甾醇也表現出廣泛的藥理活性,如抗炎、降血脂、抗腫瘤、抗血栓[7]等。此外,香葉木素等羌活的黃酮類化合物被證實有強烈的抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗阿爾茨海默病及調節免疫作用[8]。

香豆素類化合物是羌活中主要的非揮發性成分,也是發現最早、最多的一類成分[9],該結論與TCMSP數據庫篩選出來的分子靶標基本一致,說明通過網絡藥理學篩選的羌活主要分子靶標的準確性較高。

研究共預測得到羌活優效化合物的靶點183個,進一步將其進行PPI分析得到排名前10的核心基因,從化合物-靶點網絡可以推測,羌活對疾病的治療或調節作用可能通過優效化合物與關鍵靶點之間的相互作用而發揮。

這10個核心基因均為細胞色素c氧化酶的組分,驅動氧化磷酸化[10]。研究顯示,COX6B1具有增強能量消耗、抑制脂肪生成的作用[11]。COX7C對線粒體蛋白質組的維持和線粒體功能的穩定至關重要[12]。COX6C表達的變化在心血管疾病、腎臟疾病、腦損傷和腫瘤中都廣泛存在[13]。COX5A具有減少心肌細胞死亡并促進心臟恢復的作用[14],具有保護皮質神經元受到缺血缺氧損傷的作用[15]。COX4I1具有預防短暫性局灶性腦缺血損傷的作用[16],并與肥胖和2型糖尿病相關[17]。MT-CO1與腫瘤[18]、發生新心血管事件風險相關[19]。COX5B通過自噬途徑協調以平衡抗病毒信號傳導活性[20],與膿毒癥有著顯著關聯[21]。研究證實,其與年齡依賴性肥胖相關[22]。MT-CO2的表達與腫瘤預后[23]、冠狀動脈性疾病[24]相關。COX7B與癌癥的化學敏感性和耐藥性相關[25]。COX8A與脂質代謝[26]、腫瘤相關[27]。

應用網絡藥理學方法初步探索了羌活的優效化合物、關鍵靶點、核心基因等,既驗證了羌活的傳統藥理學作用,又有助于羌活潛在藥理作用和作用靶點等的挖掘,下一步還可對羌活的優效單體成分進行深入研究,為新藥開發、成藥優化、臨床闡釋等提供數據支持和研究基礎。