m6A甲基化修飾在女性生殖系統中的作用及研究進展

陶晨玥，苑秋悅，周東杰，張萍萍，周羅晶，王麗萍*

(1.揚州大學護理學院·公共衛生學院,揚州 225001;2.中國醫科大學藥學院,沈陽 110000;3.揚州大學臨床醫學院,揚州 225001;4.江蘇省揚州市婦幼保健院婦產科,揚州 225001;5.江蘇省蘇北人民醫院科技處,揚州 225001)

N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修飾是RNA中最豐富的表觀遺傳修飾方式,主要分布于5′和3′非翻譯區(untranslated region,UTR)、終止密碼子和長外顯子區,于1974年首次報道[1]。m6A甲基化修飾主要涉及m6A甲基化酶(METTL3、METTL14、WTAP)、m6A去甲基化酶(FTO、ALKBH5)和甲基化識別酶(YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、hnRNP、elF3)三者的協同作用[2-3],影響RNA的核輸出、轉運、翻譯、降解及RNA-蛋白質相互作用的生物學效應,對機體的生理或病理過程均有重要意義[4]。異常的m6A甲基化修飾可能導致基因失調,同時破壞體內平衡,從而引起腫瘤的發生及女性生殖系統疾病等病癥[5]。本文分別對m6A甲基化修飾在卵泡發育過程和女性生殖系統疾病中的作用進展進行綜述。

一、m6A甲基化修飾在卵泡發育過程中的作用

卵泡是女性生殖系統的核心功能單位,其發育過程經歷了募集、生長、優勢選擇、成熟、排卵等,在不同物種間高度相似[6]。這一復雜過程,受到機體多因素的精密調控,僅有少數原始卵泡能夠發育成熟至排卵,該過程涉及多個系統調節,并受到多種激素的調控[7]。m6A修飾不僅在卵泡發育過程中起到重要調節作用,還影響卵母細胞的減數分裂和生殖激素合成過程。

m6A修飾在卵泡發育過程中呈現出一系列的動態變化,下面分別闡述m6A甲基化轉移酶和甲基結合蛋白在調控卵母細胞減數分裂、卵泡發育及生殖激素合成過程中的作用。

1.m6A參與卵母細胞減數分裂:m6A修飾參與了卵母細胞的成熟過程。研究人員特異性敲除Gdf9-Cre小鼠卵母細胞中的METTL3,小鼠出現了卵母細胞DNA損傷、卵泡發育缺陷和排卵異常等情況。結合MeRIP-seq分析推測,METTL3可能通過靶向ITSN2進行m6A修飾以增強其穩定性,從而影響卵母細胞的減數分裂[8]。另有研究證明,敲低女性生殖細胞中的METTL3會降低mRNA翻譯效率、抑制卵母細胞成熟,并導致母體到合子轉換的缺陷[9]。較近研究表明,經m6A甲基化抑制劑環亮氨酸(CL)處理后的卵母細胞表現出卵丘擴張過程受損,線粒體中活性氧(ROS)增加,且由于破壞了紡錘體組織和染色體排列,導致卵母細胞成熟延遲等現象[10]。同樣有研究發現,在減數分裂過程中,化學誘導細胞核酸m6A修飾的減少可能會影響卵母細胞的成熟和發育能力。此外,在非哺乳動物中也證實了m6A修飾參與卵母細胞分裂和翻譯。Qi等[11]選擇非洲爪蟾卵母細胞作為研究對象,對GV期和MⅡ期卵母細胞進行m6A甲基化測序,4 207個具有m6A峰的mRNA被鑒定,這些mRNA主要參與轉錄、細胞分裂等生物學過程,而卵母細胞m6A修飾可能通過抑制mRNA翻譯來影響減數分裂的進行。

目前的研究主要集中于METTL3在卵母細胞成熟過程中的作用,其通過影響翻譯效率、破壞mRNA穩定性和生殖激素合成相關基因的表達而發揮作用。其他參與卵母細胞成熟減數分裂的m6A修飾酶有待進一步鑒定。

2.m6A參與卵泡發育:據報道,在YTHDC1fl/-Ddx4-Cre或YTHDC1fl/-Zp3-Cre雌性小鼠中,生殖細胞在MI前期發育,但被阻滯在初級卵泡階段[12]。說明YTHDC1缺失導致卵泡發育阻滯,提示YTHDC1是女性卵泡發育和成熟所必需的關鍵因子。對海蘭褐母雞的卵泡選擇進行初步研究發現,在卵泡選擇過程中,雞卵泡轉錄組被m6A廣泛甲基化,且m6A甲基化峰和m6A修飾的轉錄本在卵泡選擇過程中都有所增加,表明m6A甲基化可動態修飾調節雞的卵泡選擇[13]。病毒樣m6A甲基轉移酶相關蛋白(KIAA1429)是m6A甲基轉移酶復合物的新鑒定成分,在指導區域選擇性m6A沉積中起關鍵作用,可通過介導RNA代謝在卵泡發生和維持卵母細胞能力中發揮至關重要的作用[14]。此外,Cao等[15]通過分析豬的小卵泡和大卵泡m6A甲基化轉錄組圖譜發現,在小卵泡到大卵泡的發育過程中顆粒細胞存在大量m6A修飾并且呈動態變化,這些m6A修飾主要富集在mRNA轉錄的基因編碼區,靠近5′UTR或3′UTR的m6A修飾增加了患病風險。功能分析表明,這些差異m6A修飾的基因在類固醇激素合成和卵泡發育相關的CYP19A1、FSHR、CDC27、AKT3等多個信號通路中富集。因此,豬顆粒細胞中不同的m6A修飾可能參與了類固醇發生和卵泡發育的調節。

目前,只有部分m6A酶被證實參與卵泡的發育階段,其中大部分尚未得到深入研究,明確m6A酶與卵泡發育相關因子及上下游靶基因之間的相互作用或將成為下一步研究重點。

3.m6A參與生殖激素合成:人類的生殖功能是由促性腺激素(Gn)支持的,例如垂體在促性腺激素釋放激素(GnRH)刺激下產生卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH),FSH和LH對于卵泡的發育成熟起到重要調控作用[16]。研究人員用Gn治療大鼠模擬生理性GnRH介導的FSH合成和分泌調節,應用m6A-seq分析Gn治療前后大鼠垂體m6A的差異性修飾,共鑒定出6 413個差異峰,其中3 764個m6A峰上調,2 649個m6A峰下調,為探討m6A修飾在生殖激素分泌調節中的潛在作用奠定了基礎[17]。卵泡刺激素受體(FSHR)對FSH介導的卵泡生長和發育至關重要,FSH/FSHR的減少可能誘導卵泡生長停滯。另有研究發現,中樞基因OGN可以增加FSHR的表達,提示OGN可以調節多囊卵巢綜合征(PCOS)和卵巢癌的激素反應;同時,相關分析提示OGN功能可能與m6A修飾和鐵死亡密切相關[5]。

有研究表明,GABAAR(γ-aminobutyric acid receptor type A)受體在錳誘導未成熟雌性大鼠GnRH分泌的調節中起重要作用。抑制去甲基化酶脂肪含量和肥胖相關蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)會抑制下丘腦GABAAR蛋白表達,FTO依賴m6A去甲基化調節GnRH神經元中GABAAR mRNA的加工,導致青春期延遲發生[18]。但是,m6A修飾是否參與GnRH分泌和調節FSH和LH進而影響并參與卵泡發育還有待進一步研究。

二、m6A甲基化修飾在女性生殖系統疾病中的作用

1.m6A與早發性卵巢功能不全:早發性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)意味著原始卵泡的早期消耗,以Gn升高和雌激素缺乏為特征,是嚴重影響育齡女性卵泡發育、成熟及身心健康的卵巢功能障礙性疾病[19]。研究表明,POI患者的m6A甲基化水平高于正常人[20]。一項病例對照研究的數據表明,POI患者的卵巢顆粒細胞中的m6A含量均高于非POI患者的含量,人卵巢顆粒細胞中FTO表達下調會導致m6A水平增高,可能會損害卵巢功能并進一步增加患POI的風險[20]。在YTHDC2突變患者的外周血中,聯會復合體蛋白(SYCP2L)表達水平升高[21]。SYCP2L是早期減數分裂標記物,已被證實與POI相關[22],提示YTHDC2是人類減數分裂和POI的關鍵調節因子。

2.m6A與PCOS:PCOS是導致育齡女性不孕的常見生殖內分泌疾病,嚴重影響女性的正常生殖和生理代謝,與我國生育率下降直接相關。PCOS主要表現為原始卵泡激活數量異常增多、竇前卵泡發育減緩、卵泡存活率增加和/或卵泡閉鎖減少等,從而引起卵泡不成熟甚至不排卵的現象[23]。

通過分析控制性促排卵后正常排卵女性和非肥胖PCOS患者黃體化顆粒細胞的m6A譜,發現PCOS患者的黃體化顆粒細胞觸發m6A水平升高,深入研究發現,m6A介導的FOXO3轉錄在PCOS患者的黃體化顆粒細胞中缺失[24]。而FOXO3在細胞凋亡、代謝、細胞增殖和維持細胞活性等多種細胞生理過程中發揮重要作用[25]。此外,FTO通過降低FLOT2 mRNA的m6A水平和增加FLOT2 mRNA的穩定性來促進FLOT2的表達[26]。FLOT2缺失減弱了FTO過表達對顆粒細胞增殖/凋亡和胰島素抵抗的影響。FTO通過上調FLOT2誘導顆粒細胞功能障礙,推測其可能參與肥胖PCOS的病理生理學調控。

3.m6A與卵巢癌:卵巢癌是全世界婦女癌癥相關死亡的第五大原因,死亡率居婦科癌癥首位[27]。腫瘤抑制因子FBW7通過拮抗YTHDF2介導的BMF mRNA在卵巢癌中的衰減進而抑制腫瘤的生長和進展[28]。Liu等[29]通過對卵巢癌的多組學分析,確定了一個涉及EIF3C的新機制作為YTHDF1的直接靶點。YTHDF1通過與m6A修飾的EIF3C mRNA結合,以m6A依賴的方式增強EIF3C的翻譯,并同時促進整體翻譯輸出,從而參與卵巢癌的發生和轉移。此外,一項關于子宮內膜樣卵巢癌的m6A修飾的研究發現,敲低METTL3顯著降低COV362細胞增殖,促進細胞凋亡,并在G0/G1期誘導細胞周期停滯[30]。

4.m6A與宮頸癌:宮頸癌是全球最常見的婦科惡性腫瘤之一,也是發展中國家癌癥相關死亡的主要原因[31]。METTL14在HPV陽性和HPV陰性宮頸癌細胞的生長和侵襲中都起到重要致癌作用,METTL14基因敲除通過降低Akt和mTOR的磷酸化來抑制PI3k/Akt/mTOR信號通路,并影響下游凋亡相關蛋白的表達;沉默METTL14可以誘導宮頸癌細胞的細胞周期停滯[32]。近年來,有研究發現,YTHDF1在宮頸癌中高表達,且與宮頸癌患者的不良預后密切相關,敲低YTHDF1抑制宮頸癌細胞的生長、遷移和侵襲,并誘導細胞凋亡,甚至抑制了體內宮頸癌細胞的成瘤能力;研究還表明,YTHDF1通過調節RANBP2的表達在宮頸癌中發揮致癌作用,提示YTHDF1可作為宮頸癌治療的潛在靶點[33]。現有研究通過MeRIP-seq技術確定了TXNDC5是METTL3介導的m6A修飾的靶點,并揭示了METTL3介導的TXNDC5的表達依賴于m6A閱讀器,同時結合體內外實驗驗證METTL3通過調控TXNDC5的表達促進宮頸癌細胞的增殖和轉移,即METTL3促進了宮頸癌的惡性進展,提示METTL3可能是宮頸癌潛在的預后生物標志物和治療靶點[34]。

5.m6A與子宮內膜癌:子宮內膜癌是子宮上皮內層的惡性腫瘤,發病率和疾病相關的死亡率在世界范圍內不斷增加[35]。Zhang等[36]檢測出FTO在轉移性子宮內膜癌中高表達,深入研究發現,FTO通過催化HOXB13 mRNA 3′UTR區去甲基化修飾,從而取消與YTHDF2蛋白的m6A修飾識別。HOXB13 mRNA的下降和HOXB13蛋白表達的增加伴隨著WNT信號通路的激活及下游蛋白的高表達,導致腫瘤的轉移和侵襲,即FTO促進了癌細胞體內和體外的轉移和侵襲。以人類子宮內膜癌作為研究對象,研究發現大約70%的子宮內膜腫瘤表現出m6A修飾的減少,推測可能是由于METTL14突變或METTL3的表達降低所導致的,該結果提示m6A修飾對mRNA甲基化的減少將成為子宮內膜癌的致癌新機制[37]。此外,WTAP在癌組織中顯著上調,WATP通過甲基化CAV-1的3′-UTR并下調CAV-1的表達,激活子宮內膜癌中的NF-κB信號通路,從而促進子宮內膜癌的進展,表明WATP可作為子宮內膜癌的潛在治療靶點[38]。

三、小結與展望

目前,m6A修飾相關研究主要聚焦于基礎研究,臨床轉化相關研究非常有限。特定m6A修飾蛋白可作為反應卵泡發育障礙的生物標志物或治療靶點。研究不同m6A修飾蛋白相應抑制劑和激活劑可作為重要治療策略,廣泛應用于動物實驗中。目前已鑒定的FTO抑制劑包括CS1/2[39]、FB23[40]、Dac51[41]等。越來越多的m6A修飾蛋白對應調節劑在動物疾病模型中發揮有效治療作用。在未來,m6A調節劑可能成為治療卵泡發育障礙甚至卵巢相關疾病的重要途徑之一。

異常m6A修飾通過多種方式影響卵泡發育過程,導致卵泡發育異常,影響女性生殖功能。但m6A修飾在女性生殖系統的具體機制仍有待進一步研究,許多未知功能可能參與卵泡的發育過程。綜上所述,m6A修飾在卵泡發育過程中具有重要的調節作用,是卵母細胞發育障礙和生殖系統疾病的潛在生物標志物或治療靶點。