卵母細胞及早期胚胎脂代謝的研究進展

賈洪燕，崔毓桂

(1.南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心,南京 210029;2.南京醫科大學康達學院附屬連云港市婦幼保健院,連云港 222000)

卵母細胞在減數分裂及成熟過程中需要大量的能量,并為受精、早期胚胎發育積累大量能量,糖代謝是能量來源的一方面,而脂肪是其重要的能量儲存物質[1]。一分子軟脂酸氧化可產生105個三磷酸腺苷(ATP),而一分子葡萄糖大約為31個ATP,因而認為脂肪酸β氧化是卵母細胞成熟過程中重要的能量來源[2]。研究顯示,抑制脂肪酸β氧化則阻礙卵母細胞及早期胚胎的發育;促進脂肪酸β氧化則提高卵母細胞成熟率及早期胚胎的發育[3]。也有研究表明,高脂飲食的肥胖小鼠模型,其內分泌紊亂、卵巢儲備減少,卵母細胞內高脂累積導致氧化應激和內質網應激升高,最終導致卵母細胞成熟障礙和胚胎發育潛能低下[4]。可見,脂肪酸及脂肪酸穩態對卵母細胞發育的重要性。脂代謝在不同細胞中具有不同的作用,在免疫細胞中,脂代謝及其中間產物促進組蛋白乙酰化,并通過細胞內信號傳導調節多種淋巴細胞群的功能,在抗腫瘤和抗病毒感染中起免疫保護作用[5]。脂代謝對卵母細胞發育成熟作用的細胞內信號機制是生殖生物學領域研究的熱點之一。本文綜述卵母細胞和早期胚胎發育過程中的脂代謝及其研究進展,為不孕癥女性和高齡女性的個體化輔助生殖治療提供理論支持。

一、脂代謝的特征

脂質是種類繁多、結構復雜的一類大分子物質。人體的脂質以甘油三酯的形式儲存,在多種生物功能中發揮重要作用,包括生物膜構建、細胞信號傳導、類固醇前體產生和代謝,也是重要的營養物質來源。脂質分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸,常見的飽和脂肪酸有棕櫚酸、硬脂酸、豆蔻酸等,常見的不飽和脂肪酸有亞油酸、油酸、亞麻酸、花生四烯酸等[6]。

體內多余的脂肪以甘油三酯的形式儲存,甘油三酯是機體重要的儲能及供能物質,當脂肪動員時,甘油三酯分解成甘油和脂肪酸,脂肪酸進入線粒體進行β氧化供能,細胞內脂質以合成與分解平衡維持脂質穩態。脂肪動員時,長鏈脂肪酸在胞質活化后經肉堿協助進入線粒體基質中進行β氧化產生ATP[7]。中短鏈脂肪酸可以直接進入線粒體進行β氧化。除了供能,脂質膽固醇是機體細胞膜的重要結構成分,也是重要生物學功能的固醇化物如類固醇、膽汁酸、維生素D的前體[8]。

磷脂也是重要的生物膜組成成分,并且是機體很多重要信號通路的信號分子,也是重要的第二信使前體,如產生第二信使二酰甘油、磷脂酸、溶血磷脂酸和花生四烯酸[9],這些第二信使促發多種信號通路的激活。

二、脂代謝在卵母細胞和早期胚胎發育中的作用

人血清中的脂質與卵泡液中的脂質含量具有顯著相關性,尤其是膽固醇、高密度脂蛋白、甘油三酯、游離脂肪酸、載脂蛋白A1、肉堿,當人體發生代謝紊亂時,卵泡液中的代謝物成分也會發生相應的變化[10]。例如,肉堿通過限速酶——肉堿棕櫚酰轉移酶1(CPT1)協助長鏈脂肪酸進入線粒體內進行β氧化,是長鏈脂肪酸β氧化的激動劑。對體外受精(IVF)患者的卵泡液、卵丘細胞及卵母細胞檢測,發現卵泡液中肉堿含量與IVF結局沒有關系;肉堿合成酶在卵母細胞中表達很低,在卵丘細胞中表達很高;CPT及參與脂肪酸β氧化的部分酶在卵母細胞中高表達,也有參與脂肪酸β氧化的部分酶在卵丘細胞高表達[11]。

卵丘細胞中富集多種脂肪酸代謝相關的基因,可以調節卵泡液及卵母細胞中脂滴數量,保證卵母細胞有足夠的脂肪酸進行β氧化,為減數分裂提供能量。當卵泡液中脂肪酸濃度升高時,過多的脂肪酸積聚在卵丘細胞中,避免了卵母細胞內脂質的過度累積。當卵丘細胞失代償時,卵母細胞內脂質過多,遭受脂毒性[12]。卵母細胞則通過卵丘細胞從卵泡液里獲得脂肪酸;卵泡液中脂肪酸含量過高或過低,對卵母細胞及胚胎的早期發育均不利。與顆粒細胞相比,哺乳動物的卵母細胞線粒體一般比較圓,線粒體內膜光滑,嵴較少,數量多,且卵母細胞和早期胚胎中線粒體mtDNA拷貝數很高,甲基化程度比顆粒細胞低[13]。這種形態提示卵母細胞和早期胚胎處于較低的能量代謝活動,維持較低水平的電子傳遞鏈以有效地滿足自身能量的需求,同時最低量產能可以減低與氧化磷酸化相關的活性氧(ROS)的形成,即所謂的安靜胚胎假說[14]。

研究發現,卵母細胞從生發泡(GV期)至第二次減數分裂中期(MⅡ期)脂肪酸β氧化相關代謝物(如左旋肉堿、棕櫚酰左旋肉堿)逐漸增多,提示脂肪酸分解供能增多[15],也說明脂肪酸β氧化在卵母細胞成熟過程中具有重要作用,并為受精后的胚胎發育提供能量儲備。一些脂質代謝的中間產物是卵母細胞減數分裂和成熟的重要調控因子。脂肪酸β氧化對卵母細胞核成熟至關重要[16]。卵母細胞的能量代謝依賴線粒體,而受精卵的線粒體全部來自卵母細胞,所以,卵母細胞的能量代謝影響胚胎的代謝,也可能影響下一代的能量代謝。

通過代謝組學和轉錄組學分析表明,胚胎2細胞期有更多的蛋氨酸、多胺、谷胱甘肽的代謝,囊胚期具有更高的與線粒體三羧酸循環相關的代謝產物,說明隨著胚胎的發育,能量需求逐漸增高[17]。卵母細胞和卵裂期胚胎耗氧量低于桑葚胚和囊胚,當胚胎發育至桑葚胚和囊胚時,除了糖類供能,脂肪酸氧化(FAO)也可塑性地提供能量滿足胚胎發育的能量需求[18]。有超過130種哺乳動物的胚胎在囊胚期經歷發育靜止階段,這對后續的分化發育具有重要的意義。然而這期間脂代謝沒有降低,反而是升高的,可能機制是囊胚停滯期存在一些基因的可變剪切異構體,比如肝激酶B1(LKB1)有長和短兩種形式蛋白,在停滯期只表達長形式的蛋白,導致下游腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)不能被激活,進而不能阻斷雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活化通路,導致糖酵解和脂肪酸氧化增加[19]。該種機制還需要進一步探究。

脂肪酸顯然在能量儲存中起著重要的作用,但它們也在生物膜的構建中起著重要的作用,這是胚胎分裂過程中細胞膜表面積大幅增加的重要原因,僅在2細胞和4細胞胚胎階段,細胞膜就增加了74%,可推測在后期的胚胎植入前階段,細胞膜的增加幅度更大。在卵母細胞減數分裂成熟過程中,脂質除了提供能量,也是不可缺少的信號分子,如磷酸肌醇信號通路控制卵母細胞減數分裂的恢復[20]。

三、脂質代謝異常影響卵母細胞和早期胚胎發育

高脂喂養小鼠建立肥胖小鼠模型,發現卵巢明顯縮小、卵母細胞線粒體形態異常、減數分裂時非整倍體增加、早期胚胎丟失率增加,以及早期囊胚前出現的缺陷導致胎兒發育遲緩和腦發育異常[21]。同時,動情周期縮短,GV期和MⅡ期卵母細胞含較高的游離脂肪酸使細胞內產生較高的ROS水平以及內質網應激,從而減少囊胚的形成[4]。體外培養卵母細胞時,與添加低濃度(72 μmol/L)的游離脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸和油酸混合)相比,添加高濃度(720 μmol/L)游離脂肪酸(棕櫚酸、硬脂酸和油酸混合)對卵母細胞的發育不利,且降低胚胎卵裂率和囊胚形成率;單純的高硬脂酸(140 μmol/L)、高油酸(210 μmol/L)均阻礙卵母細胞發育、顯著降低胚胎發育潛能[22]。較高濃度的飽和脂肪酸,如棕櫚酸,對卵母細胞及其早期胚胎有“脂毒性”,可抑制卵母細胞及其早期胚胎的發育,可能機制是棕櫚酸影響卵母細胞的組蛋白修飾,如H4K12乙酰化和H3K9去甲基化,以及抑制與囊胚形成相關的OCT4、CDX2、粘蛋白等因子。相對而言,不飽和脂肪酸,如油酸,對卵母細胞及早期胚胎的發育有積極作用,在體外培養卵母細胞及胚胎過程中添加不飽和脂肪酸(油酸)可抵消卵母細胞暴露于棕櫚酸或硬脂酸的負面影響[23-25]。因此,飽和/不飽和脂肪酸的比值對卵母細胞及胚胎發育潛能有重要的影響。

肥胖女性容易發生不孕,懷孕后胎兒及新生兒出現問題的概率偏高。研究表明,肥胖女性的卵母細胞中調控氧化應激、脂代謝和炎癥等基因高表達,亞油酸和硬脂酸濃度增高[26]。一項前瞻性隊列研究顯示,體質量指數(BMI)越高,MⅡ期卵母細胞越少、優胚率越低;經輔助生殖技術(ART)助孕而沒有妊娠的女性,其卵泡液中的棕櫚酸顯著增高[27]。國內也有研究表明,肥胖的女性血脂升高,卵泡液中氧化應激水平升高,通過體重管理后,血脂及卵泡液氧化應激水平下降,優胚率及累計妊娠率均顯著提高[28]。但是,另有研究檢測ART取卵時獲得的卵泡液發現,不同BMI人群的卵泡液中脂代謝中間物并沒有顯著差別[10]。以上研究結果并不能說明BMI跟卵母細胞生長的微環境沒有關系,首先是研究樣本量有限,其次大部分超重或肥胖女性在進行ART前都進行了體重管理,進而改善了自身的代謝,卵泡液代謝物成分也隨之發生改變。更多實驗結果表明,平衡肥胖女性卵泡液中飽和和不飽和脂肪酸組成成分,改變體外成熟(IVM)培養液中脂質組成比,將改善肥胖女性的卵母細胞及早期胚胎的發育潛能[23-25]。

卵巢低反應(POR)人群卵巢儲備減少,獲卵數少,臨床妊娠率低。分析卵泡液代謝組學發現,與正常女性相比,POR女性的卵泡液中脂代謝相關代謝中間物(亞油酸、油酸、花生四烯酸、二十六碳六烯酸等)顯著下調,提示這些脂質代謝物可以作為POR的生物標志物[29]。與年輕人群相比,高齡人群在ART治療過程中檢測卵泡液提示,糖代謝、脂代謝相關產物減少,氨基酸代謝升高,與卵巢功能減退、卵母細胞質量差相關[30]。卵巢功能減退與血清中不飽和脂肪酸的濃度呈正相關,但改善脂代謝能否提高卵巢功能尚不明確[31]。多囊卵巢綜合征(PCOS)人群是典型的卵巢高反應,卵巢呈多囊樣改變,但是很少排卵,卵母細胞質量及胚胎發育潛能低下、著床率低、流產率高,代謝組學分析提示肥胖的PCOS女性血清及卵泡液中棕櫚酸和油酸含量顯著升高[32]。上述結果提示,POR、高齡、PCOS等人群的卵母細胞線粒體中糖代謝與脂代謝失去了平衡,導致卵母細胞及胚胎質量下降。

四、改變卵母細胞脂代謝與胚胎發育結局

卵母細胞FAO相關基因受LH峰值的調節,但是在IVM條件下,FSH和表皮生長因子使卵母細胞脂代謝相關基因表達失調,且體內成熟卵泡液中脂質成分與IVM培養液血清中脂質成分不同,均導致IVM時脂代謝基因表達失調,FAO存在缺陷[1]。以上研究結果表明,優化IVM培養液中脂質成分,對改善ART結局非常重要。

肉堿協助活化的脂肪酸進入線粒體進行β氧化產生ATP,近年來被應用于改善生殖細胞功能。肉堿改善能量代謝和卵母細胞及胚胎質量的機制仍需進一步研究,肉堿可能通過抗凋亡、抗糖、抗氧化、抗炎等信號通路改善卵母細胞及胚胎的發育潛能[33]。在IVM培養液中加入肉堿,卵母細胞第一極體排出率增加,線粒體DNA拷貝數增加,降低ROS,增加ATP,同時調節卵母細胞旁分泌因子,增加類固醇激素的產生,從而提高卵母細胞成熟率及早期胚胎的發育潛能[34]。給PCOS小鼠模型灌胃肉堿,可通過抗氧化、抗糖化等路徑和增加線粒體功能改善PCOS癥狀[35]。研究發現,214例接受IVF-ET未獲得妊娠的女性口服左旋肉堿后,獲卵數、卵母細胞成熟率及受精率無顯著變化,但胚胎質量顯著改善[36]。

豬卵IVM過程中,在培養液中分別添加150 μmol/L硬脂酸、油酸,均未影響卵母細胞成熟率,加入硬脂酸也沒有影響囊胚形成率,而加入油酸則提高了囊胚形成率,同時,顆粒細胞脂質合成相關基因(ACACA、PLIN2、SCD、FADS1、FADS2)均上調,且細胞內脂滴數量及所占容積均增加[37],說明顆粒細胞通過增加自身的脂質儲存降低了卵泡液中高濃度的脂肪酸對卵母細胞的“脂毒性”作用,維持了卵母細胞內脂質的穩態。但是,高濃度的脂肪酸超出了顆粒細胞的代償能力,間接地使卵母細胞內脂質穩態失衡,損害卵母細胞的發育。在IVM培養基中加入高濃度棕櫚酸(468 μmol/L)、硬脂酸(194 μmol/L)、油酸(534 μmol/L),通過轉錄組學及表觀遺傳學分析,發現高濃度脂肪酸降低卵母細胞成熟率和囊胚形成率,其機制主要涉及炎癥、細胞凋亡、代謝紊亂及氧化應激等相關的信號通路[38]。

將CPT1抑制劑-依托莫西加入IVM培養液中并培養24 h后,可以延遲牛的卵丘卵母細胞復合物(COC)中卵母細胞及裸卵的減數分裂,將其阻滯在MⅠ期前,并且依托莫西可以降低卵丘細胞和COC的活性,但不影響裸卵的活性,說明卵丘細胞中FAO對維持代謝穩態具有重要作用,且可能影響COC中卵母細胞的活性及減數分裂[39]。脂肪合成對胚胎的發育至關重要,敲除脂肪酸合成酶(FAS)基因的小鼠胚胎在種植前死亡,提示應用抑制FAS功能進行減肥或者控制腫瘤生長是非常危險的[40]。在IVM培養基中加入脂肪合成的抑制劑-淺藍菌素,可以促進COC中卵母細胞減數分裂的恢復,但不能促進裸卵的成熟。加入藥物C57促進FAO同時抑制脂肪酸的合成,可以促進COC和裸卵的減數分裂恢復。這些體外實驗證明了FAO在卵母細胞減數分裂恢復過程中的作用大于脂肪酸的合成[41]。

五、結語及展望

游離脂肪酸進入線粒體β氧化產生ATP是卵母細胞及早期胚胎發育的重要能量來源,但高濃度的脂肪酸或者多種脂肪酸比例失調產生較多的ROS及代謝產物堆積,對細胞有一定的脂毒性。卵母細胞可通過卵丘細胞從卵泡液里獲得脂肪酸,所以卵泡液里飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的組成比例對卵母細胞的發育很重要。肥胖、POR、POCS等人群卵泡液中脂質組成比不同,卵母細胞中脂代謝亦不同,從而影響受精及胚胎的發育。對有生育需求的人,控制飲食、體重,改善脂代謝,對獲得優質胚胎至關重要。ART過程中調整不同人群培養液中脂質成分比,或加入促進脂肪酸β氧化的藥物,將有利于改善ART結局,尤其是IVM結局。