溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3調控內皮細胞激活

張漢寧，張成虎，武宗寅

1.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院），山東濟南 250117；2.山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）附屬濟寧市第一人民醫院心內科，山東濟寧 272000

動脈粥樣硬化是心血管疾病發生發展的主要致病因素，由于脂質在血管內膜下的沉積、炎癥細胞的浸潤，病因復雜，其發病機制和病理過程目前還沒有完全被闡明[1]；內皮細胞可以感受來自血液的各種機械信號和化學信號刺激，介導炎性反應，是心血管疾病發生的主要病理機制[2]。研究發現局部血流動力學改變在內皮細胞激活及動脈粥樣硬化形成中起著重要作用[3]。

溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3（Lyso-PL Acyltransferases 3, LPCAT3）可以調控甘油磷脂sn-2位置的脂肪酸合成，催化多不飽和脂肪酸與磷脂的結合，參與磷脂重塑、內質網應激、炎癥反應，進而可以調控細胞的功能[4]。前期天津醫科大學的研究發現湍流通過調控Integrin α5-ANXA2信號軸引起內皮細胞激活，還可以通過抑制哺乳動物MST1的激酶活性介導動脈粥樣硬化的形成[5-6]。基于LPCAT3調控磷脂重塑的重要作用，其是否可以參與內皮細胞激活還沒有被研究，探究LPCAT3在內皮細胞激活以及動脈粥樣硬化的作用具有重要意義。因此本研究于2020年11月—2023年6月在濟寧市第一人民醫院對5只C57BL/6雄性小鼠及原代人臍靜脈內皮細胞進行實驗研究，旨在探索LPCAT3在內皮細胞激活中作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 M199培養基（武漢普諾賽科技公司；PM150612）、胎牛血清（廣州漢強生物科技公司；UB96728）、胰酶（美國Gibco公司；25200-056）、RNAiMAX轉染試劑（美國ThermoFisher公司；13778075）、LPCAT3小分子干擾RNA（北京唯尚立德生物科技公司；序列CAAGUUCCUUGGAAAUAAATT）、mRNA提取試劑盒（廣州Omega Bio-Tek公司；R6834）。

1.1.2 儀器 CO2細胞培養箱（美國Thermo公司）、PCR儀（美國Bio-rad公司）、實時熒光定量PCR儀（美國Bio-rad公司）、4℃離心機（美國Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的構建 5只8周齡雄性背景為C57BL/6的Wide-Type（WT）小鼠購自濟南朋悅公司。小鼠在溫濕度控制的環境中適應1周，按12 h的光-暗周期飼養，給予正常飲食，自由獲取食物和水。1周后分離小鼠主動脈弓（Aortic Arch, AA）以及胸主動脈（Thoracic Aorta, TA）并提取組織的mRNA。動物實驗均通過本院醫學實驗動物倫理委員會審查（JNMC-2021-PW-047）。

1.2.2 原代人臍靜脈內皮細胞的培養與湍流模型構建 進行原代人臍靜脈內皮細胞培養（以下簡稱內皮細胞）及湍流模型構建[7]。將培養的原代人臍靜脈內皮細胞，隨機分為對照組（Static）（n=3）和研究組（OSS）（n=3），研究組用階梯式平板流體系統給予內皮細胞湍流（0.5±4）dyn/cm2處理12 h，最后將流體系統置于5%CO2、37℃細胞培養箱中運行，對照組靜止處理12 h，與研究組一起置于5%CO2、37℃細胞培養箱。

1.2.3 SiRNA基因沉默 將內皮細胞分為沉默LPCAT3組（siLPCAT3）（n=3）與對照組（siNC）（n=3）。將內皮細胞鋪于六孔板進行培養，細胞密度在75%左右進行轉染；LPCAT3組每孔分別將轉染試劑RNAimax、SiRNA-LPCAT3（10 μM）與Opti-MEM充分混勻并靜置，對照組每孔分別將轉染試劑RNAimax、陰性對照SiRNA（10 μM）與Opti-MEM充分混勻并靜置；將復合物轉染到相應處理孔，孵育6 h換液，24 h后收集細胞裂解液提取mRNA驗證敲減效率。為了進一步研究LPCAT3在湍流介導的內皮細胞激活中作用，將內皮細胞分為siNC（n=3）、siLPCAT3（n=3）、OSS（n=3）、OSS+siLPCAT3（n=3）4組，分別給予SiRNA-LPCAT3轉染12 h及湍流（0.5±4）dyn/cm2處理12 h，收集細胞裂解液。

1.2.4 mRNA的提取 按mRNA提取試劑盒（廣州Omega Bio-Tek公司；R6834）步驟提取。

1.3 統計方法

本研究中收集的實驗數據采用GraphPad Software分析、制圖，mRNA表達水平以（±s）表示，兩組間比較采用非配對t檢驗；4組間比較采用雙因素方差分析，進一步兩組組間比較采用邦弗朗尼（Bonferroni）后續檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 湍流上調LPCAT3的mRNA表達水平

與對照組（Static）VCAM-1、ICAM-1、LPCAT3的相對mRNA表達水平（1.0±0.14）、（1.0±0.22）、（1.0±0.08）相比，研究組（OSS）（2.01±0.61）、（1.6±0.18）、（1.89±0.32）顯著增加（見圖1A），差異有統計學意義（P均＜0.05）；為了進一步驗證湍流對于LPCAT3的影響，提取Wide Type小鼠AA（血流形式主要是湍流）以及TA組織的mRNA，結果表明AA其LPCAT3的相對mRNA水平（2.03±0.5）較TA（1.0±0.42）明顯上調（見圖1B），差異有統計學意義（P＜0.05）。研究組內皮細胞LPCAT3的mRNA表達水平相比于對照組升高1.88倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 湍流上調LPCAT3的mRNA表達水平

2.2 LPCAT3沉默抑制湍流介導的內皮細胞激活

與對照組（siNC）內皮細胞（1±0.06）相比，沉默LPCAT3組（siLPCAT3）其mRNA表達水平（0.07±0.04）明顯被抑制（見圖2A），差異有統計學意義（P＜0.001）；siNC組（1.0±0.38）（1.0±0.29）與siLPCAT3組內皮細胞VCAM-1、ICAM-1的mRNA相對表達水平（0.96±0.41）（0.68±0.2）比較，，差異無統計學意義（P均＞0.05）（見圖2B、2C）；對比研究組（OSS）（2.72±0.72）（3.04±0.56），OSS+siLPCAT3組內皮細胞VCAM-1、ICAM-1的mRNA相對表達水平（1.31±0.4）（1.81±0.51）顯著降低（見圖2B、2C），差異有統計學意義（P＜0.001）。

圖2 LPCAT3沉默抑制湍流介導的內皮細胞激活

3 討論

血管內皮細胞在動脈粥樣硬化的發病過程中發揮著首要的作用，其在血管分叉處或彎曲處被激活，觸發炎癥反應，進而介導動脈粥樣硬化的形成[8]。研究表明細胞外基質蛋白COMP與整合素錨定，通過湍流改變integrin的構象介導NF-κB激活[9]；在湍流的作用下，ANXA2通過在內皮細胞中發生構象變化直接與整合素α5相互作用，促進整合素α5向質膜脂筏轉運引起內皮細胞激活[5]；最新研究表明湍流通過抑制MST1的激酶活性，使其對底物Cx43的磷酸化水平降低，引起Cx43介導的半通道開放，進而介導內皮細胞激活和動脈粥樣硬化[6]。目前內皮細胞激活以及動脈粥樣硬化的發病機制被廣泛研究，但其病因復雜，具體發病機制還沒有完全被闡明。本研究發現湍流可以促進LPCAT3的mRNA表達，說明LPCAT3在湍流引起的內皮細胞激活中可能發揮重要作用。

LPCAT3在細胞和組織中都廣泛參與溶血磷脂酰轉移酶的諸多生理過程，其可以調節不同磷脂酰膽堿種類的豐度，進而在脂代謝和生態穩定中發揮重要作用[10]。O.Demeure等[11]研究發現LPCAT3受肝臟X受體調控，參與肝臟和小腸脂蛋白生成，許多疾病的發展都與LPCAT3的促炎作用有關[12]。Jiang X等[13]研究顯示，與對照組相比，SiNPs顯著增加內皮細胞LPCAT3的mRNA表達，誘導內皮細胞發生鐵死亡。吳思毅等[14]研究顯示秦皮素通過減輕內皮細胞鐵死亡，延緩高脂飲食小鼠動脈粥樣硬化的發展。這些研究結果說明了內皮細胞中LPCAT3高表達可能與動脈粥樣硬化形成密切相關。本研究顯示，通過對比對照組LPCAT3的相對mRNA表達水平（1.0±0.08）與研究組（1.89±0.32）（P＜0.05），發現湍流可以促進內皮細胞LPCAT3的mRNA表達。與小鼠胸主動脈LPCAT3的相對mRNA（1.0±0.42）比較，主動脈弓表達（2.03±0.5）明顯升高（P＜0.05），提示湍流在生理狀態下同樣會促進血管內皮LPCAT3的mRNA表達。對比研究組（OSS）VCAM-1、ICAM-1的相對mRNA表達水平（2.72±0.72）（3.04±0.56），OSS+siLPCAT3組為（1.31±0.4）（1.81±0.51）（P均＜0.05），發現沉默LPCAT3能夠明顯抑制湍流介導的內皮細胞VCAM-1、ICAM-1的mRNA水平，這說明了湍流通過促進LPCAT3生成介導的內皮細胞激活。

越來越多的研究表明LPCAT3主要調節花生四烯酸-PC的水平，是游離花生四烯酸的主要調節因子，而游離花生四烯酸是動脈粥樣硬化發生的重要因素[15-16]。湍流是否可以調節花生四烯酸-PC的豐度以及是否可以通過LPCAT3介導溶血磷脂酰膽堿以及花生四烯酸的表達目前還沒有完全被揭示，因此還需要進一步研究湍流對于LPCAT3的調節是否會影響花生四烯酸-PC以及游離花生四烯酸的表達進而引起內皮細胞的激活以及動脈粥樣硬化的形成。

綜上所述，本研究證實湍流通過上調LPCAT3的表達介導內皮細胞的激活，可能為動脈粥樣硬化的治療和預防提供了新的干預靶點。