鴉膽子結合吡柔比星對膀胱癌細胞作用的影響

孫士恒，夏似龍，張博，周大宏

黑龍江省醫院泌尿一科，黑龍江哈爾濱 150036

膀胱癌為泌尿系常見惡性腫瘤。該病發病原因復雜，一般認為與內在、外在因素共同作用引發有關，以血尿、排尿障礙為主要臨床表現[1]。吡柔比星（Pirarubicin）為該病主要抗腫瘤藥物[2]。但在用藥治療期間存在腫瘤細胞耐藥情況，影響患者病情控制效果，威脅其生命安全。鴉膽子是一種清熱解毒藥。現代藥理研究發現，鴉膽子油乳具有抗炎、殺菌、止痛等作用[3]。有研究發現，在對膀胱癌患者治療中，通過基因水平靶向調控作用，可提升腫瘤細胞藥物敏感性[4]。核因子κB（Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB）為化療中誘導細胞耐藥重要環節，經上游信號通路啟動DNA合成，促進細胞增殖，誘導惡性腫瘤進展[5]。腺苷三磷酸（Adenosine Triphosphate, ATP）結合轉運蛋白G家族成員2（ATP-binding Cassette Superfamily G member 2，ABCG2）為細胞膜表面蛋白，其表達上調可能會增強ATP將藥物從細胞內向細胞外轉移能力，增加細胞耐藥性[6]。為此，選取2023年4—5月期間黑龍江省醫院泌尿科1株人BIU-87膀胱癌細胞株為研究對象，分析鴉膽子油乳對膀胱癌細胞增殖、凋亡及耐藥情況影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

研究所用細胞及主要試劑見表1。本次研究經本院醫學倫理委員會審核批準通過（SYYLLBA2022041）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及預處理 人BIU-87膀胱癌細胞，接種于RPMI-1640培養液中（包含100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、10%胎牛血清），5%CO2、37℃、濕度100%環境培養。取對數生長期細胞，0.15%胰酶+0.1乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraacetic Acid，EDTA）消化處理制成單細胞懸液；細胞計數，以1×106/L濃度接種培養瓶中繼續培養；細胞生長至半融合狀態時進行預處理：細胞恒溫孵育（水浴，42℃，30 min），移出細胞后培養（5%CO2、37℃、濕度100%）24 h時進行實驗。

1.2.2 分組情況 將細胞以5×104個/mL接種于96孔板中，100 μL/孔；設置1組空白對照，均添加吡柔比星，濃度為5 μmol/L，并分別加入0、5、10、20、30 mL/L濃度鴉膽子油乳，培養24 h時進行實驗研究。

1.2.3 細胞增殖抑制率觀察 每孔加20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續培養4 h后終止培養，棄上清，每孔加100μL 二巰基丁二酸（Dimercaptosuccinic Acid, DMSA），振蕩使晶體溶解后，酶標儀492 nm處讀取吸光值（D），計算細胞增殖抑制率（Proliferation Inhibition Rate，IR）；IR=（1-D試驗孔/D對照孔）。

1.2.4 細胞凋亡情況觀察 使用凋亡檢測試劑盒檢測。細胞以0.12%胰酶消化，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Saline，PBS）洗滌2次后，加入200 μL結合緩沖液混勻后，加10 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）避光染色15 min，應用流式細胞儀檢測，利用Cellquest軟件分析細胞壞死及凋亡情況，統計記錄細胞壞死率、凋亡率。

1.2.5 細胞周期情況 取各組細胞，棄上清，PBS沖洗2次，70%冷乙醇中重懸過夜固定（4℃）；檢測前離心（離心條件：1 000 r/min，10 min），棄上清，PBS洗滌2次，加25 μL 2 mg/mL核糖核酸酶A，37℃下靜置30 min，加25 μL PI染料，避光染色30 min，經流式細胞儀檢測確定細胞周期。

1.2.6 NF-кB表達情況 以Western印跡法檢測NF-кB表達情況，即依據細胞質、細胞核蛋白分離抽提試劑盒說明書進行蛋白質提取。每組蛋白樣本定量后，各取30 μg進行不連續10% SDS-PAGE，電轉移至硝酸纖維膜后，以5%脫脂奶粉室溫封閉（1 h），加1 ∶ 1 000稀釋的兔抗人NF-кB/p65多克隆抗體、β-action多克隆抗體（細胞質內參）、1:500稀釋的兔抗人TBP多克隆抗體（細胞核內參），4℃過夜。加1 ∶ 3 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為一抗，室溫孵育2 h，加電化學發光試劑，X線膠片曝光并掃描，以Quantity One v4.62凝膠定量軟件分析蛋白條灰度值，通過細胞核、細胞質內參統計細胞核、細胞質中NF-кB蛋白相對表達水平，以對照組比值為100%標準化處理后，對各組蛋白表達量半定量分析。

1.2.7 ABCG2表達情況 以Western印跡法檢測ABCG2表達情況。與“1.2.6”中相同方法提取總蛋白后，以二喹啉甲酸（Bicinchoninic Acid，BCA）法定量40 μg樣品上樣，以SDS-PAGE法分離蛋白質，以5%脫脂奶粉室溫封閉（1 h），添加ABCG2一抗，4℃過夜，添加ABCG2二抗孵育1 h，加電化學發光試劑，X線膠片曝光并掃描，以Quantity One v4.62凝膠定量軟件分析蛋白條灰度值，以GAPDH為內參，統計細胞膜上ABCG2相對表達水平，蛋白定量方法與“1.2.6相同”。

1.3 質量控制

每組細胞均進行3個平行樣本，每個樣本細胞均設置5個復孔（每組共計15個樣本量）；每個樣本重復檢測3次，取3次檢測結果平均值。

1.4 統計方法

采用SPSS 24.0統計學軟件分析數據，細胞增殖抑制率、壞死率、凋亡率、細胞周期、NF-кB、ABCG2表達為計量資料，符合正態分布，以(±s)表示，行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度鴉膽子油乳對BIU-87細胞增殖抑制率、壞死率、凋亡率影響

隨鴉膽子油乳濃度升高，BIU-87細胞增殖抑制率、壞死率、凋亡率逐漸升高，差異有統計學意義（P均＜0.05）；鴉膽子油乳濃度為5 mL/L時細胞增殖抑制率、細胞壞死率顯著提升，濃度≥10 mL后，細胞凋亡率顯著提升，差異有統計學意義（P均＜0.05），見表2。

表2 不同濃度鴉膽子油乳對BIU-87細胞增殖抑制率、壞死率、凋亡率影響[(±s)，%]

表2 不同濃度鴉膽子油乳對BIU-87細胞增殖抑制率、壞死率、凋亡率影響[(±s)，%]

注：細胞增殖抑制率中，不同鴉膽子油乳濃度比較，①P＜0.05；與鴉膽子油濃度為0時細胞增殖抑制率比較，②P＜0.05；壞死率中，不同鴉膽子油乳濃度比較，③P＜0.05；與鴉膽子油濃度為0時壞死率比較，④P＜0.05；凋亡率中，不同鴉膽子油乳濃度比較，⑤P＜0.05；與鴉膽子油濃度為0、5 mL/L時凋亡率比較，⑥P＜0.05。

凋亡率（3.62±0.75）⑤（4.10±1.03）⑤（15.52±2.79）⑤⑥（17.14±2.05）⑤⑥（19.07±2.44）⑤⑥鴉膽子油乳濃度0（n=15）5 mL/L（n=15）10 mL/L（n=15）20 mL/L（n=15）30 mL/L（n=15）細胞增殖抑制率（5.41±1.20）①（55.71±6.79）①②（71.88±7.20）①②（75.43±6.23）①②（80.15±7.15）①②壞死率（6.63±1.35）③（35.49±5.31）③④（29.33±4.29）③④（30.30±6.72）③④（31.35±5.88）③④

2.2 不同濃度鴉膽子油乳對BIU-87細胞周期影響

隨鴉膽子油乳濃度升高，BIU-87細胞中S期細胞占比降低，C0/C1期細胞占比升高，差異有統計學意義（P均＜0.05），見表3。

表3 不同濃度鴉膽子油乳對BIU-87細胞周期影響[(±s)，%]

注：S期中，不同鴉膽子油乳濃度比較，①P＜0.05；C0/C1期中，不同鴉膽子油乳濃度比較，②P＜0.05。

C0/G1期（51.20±7.51）②（68.42±5.32）②（71.55±6.40）②（75.54±4.83）②（82.79±5.24）②鴉膽子油乳濃度0（n=15）5 mL/L（n=15）10 mL/L（n=15）20 mL/L（n=15）30 mL/L（n=15）S期（42.53±3.16）①（25.41±2.88）①（21.21±3.02）①（18.43±2.10）①（14.02±1.95）①

2.3 不同濃度鴉膽子油乳對BIU-87細胞NF-кB、ABCG2表達情況影響

隨鴉膽子油乳濃度升高，細胞質中NF-κB表達量逐漸下降，細胞核中NF-κB表達量逐漸升高，細胞膜表面ABCG2表達量下降，差異有統計學意義（P均＜0.05），見表4。

表4 不同濃度鴉膽子油乳對BIU-87細胞NF-кB、ABCG2表達情況影響[(±s)，%]

表4 不同濃度鴉膽子油乳對BIU-87細胞NF-кB、ABCG2表達情況影響[(±s)，%]

注：細胞質中NF-кB表達量中，不同鴉膽子油乳濃度比較，①P＜0.05；細胞核中NF-кB表達量中，不同鴉膽子油乳濃度比較，②P＜0.05；細胞膜中ABCG2表達量中，不同鴉膽子油乳濃度比較，③P＜0.05。

細胞膜中ABCG2表達量（1.32±0.11）③（0.95±0.21）③（0.76±0.12）③（0.54±0.07）③（0.43±0.08）③鴉膽子油乳濃度0（n=15）5 mL/L（n=15）10 mL/L（n=15）20 mL/L（n=15）30 mL/L（n=15）細胞質中NFкB表達量（0.89±0.21）①（0.60±0.15）①（0.48±0.10）①（0.45±0.08）①（0.37±0.11）①細胞核中NFкB表達量（0.86±0.15）②（2.21±0.30）②（2.44±0.57）②（2.52±0.38）②（2.70±0.44）②

3 討論

吡柔比星為膀胱癌主要治療藥物，通過將腫瘤細胞停滯在G2細胞期來抑制細胞分裂過程，促進細胞凋亡。在對膀胱癌治療中，吡柔比星膀胱熱灌注治療可通過其熱效應增加與腫瘤細胞接觸，以控制膀胱癌進展，降低腫瘤臨床分期，且局部灌注治療可降低化療藥物全身性不良反應，提升治療安全性[7]。但在應用吡柔比星治療中，部分患者存在藥物治療敏感性差，或吡柔比星耐藥情況，使患者出現病情反復、原位腫瘤控制不理想等情況，影響預后。因此在對膀胱癌患者應用吡柔比星治療基礎上，如何聯合用藥可提升患者化療藥物敏感性，為目前研究關鍵。

鴉膽子屬中藥飲片，其中鴉膽子油乳主要成分為油酸及亞油酸[8]。有研究發現，鴉膽子油乳能夠抑制腫瘤細胞DNA合成，破壞腫瘤細胞生物膜結構，抑制腫瘤內部血管新生，因此起到抗腫瘤作用[9-10]。而將其應用于接受吡柔比星熱灌注治療的膀胱癌患者中，是否可起到協調作用、增強患者對吡柔比星藥物敏感性研究較少。本次研究結果顯示，與單純應用吡柔比星（鴉膽子油乳濃度為0時）相比，聯合不同濃度鴉膽子油乳，均會增強腫瘤細胞增殖抑制作用，并促進腫瘤細胞壞死及凋亡，分析原因為，鴉膽子苦醇可抑制NRF2基因表達，以抑制腫瘤細胞增殖過程，促進腫瘤細胞凋亡[11]，通過RhoA/RO CK1信號通路抑制腫瘤細胞遷移及侵襲[12]，同時可通過Nrf2/HO-1通路誘導鐵死亡，以促進腫瘤細胞凋亡[13]，可能為聯合鴉膽子油乳后對腫瘤細胞增殖抑制、促進細胞凋亡影響因素之一。同時在本次研究中發現，低濃度鴉膽子油乳可促進腫瘤細胞損傷，高濃度則促進腫瘤細胞凋亡，而經腫瘤增殖抑制作用中可見，其對腫瘤細胞作用過程存在劑量依賴性。

本次研究結果顯示，隨鴉膽子油乳濃度升高，BIU-87細胞中S期細胞占比降低，C0/C1期細胞占比升高（P均＜0.05），且隨鴉膽子油乳濃度升高，細胞質中NF-κB表達量逐漸下降，細胞核中NF-κB表達量逐漸升高（P均＜0.05），考慮原因為，NF-κB是一種控制DNA轉錄的蛋白質復合物，在機體炎癥反應、惡性腫瘤后，其在細胞核中大量合成分泌到細胞質中，用于參與細胞增殖、分化及凋亡，并促進血管新生[14]；聯合鴉膽子油乳后，該藥本身會造成腫瘤細胞損傷、干擾腫瘤細胞增殖過程，加速吡柔比星經細胞外間質進入細胞內，參與至腫瘤細胞DNA中，抑制細胞增殖分裂過程，將細胞停滯在C0/G1期，抑制細胞核對NF-κB合成作用，進而降低NFκB從細胞核向細胞質分泌過程，促進細胞對NFκB穩定分泌能力，降低細胞質中NF-κB水平，并抑制細胞增殖分裂[15-16]。

本次研究結果顯示，隨鴉膽子油乳濃度升高，細胞膜表面ABCG2表達量下降，考慮原因為，ABCG2為細胞膜表面蛋白，其表達水平上調會通過ATP向細胞外排出藥物成分；應用鴉膽子油乳后可下調ABCG2表達過程，關閉藥物成分經細胞膜排出通道，增強吡柔比星對腫瘤細胞DNA作用能力；而隨鴉膽子油乳濃度增加，其對ABCG2表達下調控制能力增強，而經本實驗室研究結果得出，miR-144-3p與ABCG2具有直接靶向關系，提示鴉膽子油乳可能對miR-144-3P具有上調作用，使腫瘤細胞對吡柔比星持續表達出高度藥物敏感性，可能為該藥濃度升高后腫瘤增殖抑制能力增強、損傷凋亡數量增加主要影響因素[17]。付皓云等[18]在其研究中發現，鴉膽子油乳（40 mg/L）可顯著抑制食管鱗狀癌細胞增殖[（4.48±0.08）% vs（6.61±0.12）%]，促進腫瘤細胞凋亡[（19.60±3.15）% vs（5.37±1.20）%]，與本次研究的[（80.15±7.15）% vs（5.41±1.20）%]、[（19.07±2.44）% vs（3.02±0.45）%]結果一致。但本次研究重點為鴉膽子油對吡柔比星治療耐藥機制影響，可為該病臨床方案制訂提供更準確參考依據。

綜上所述，鴉膽子油乳結合吡柔比星，可抑制BIU-87膀胱細胞株增殖，低濃度可促進細胞壞死，高濃度可促進細胞凋亡，并降低細胞質中NF-κB表達量，抑制ABCG2表達，其效果均存在劑量依賴性。