DCLK1單克隆抗體在結直腸癌中的表達以及影響因素分析

杜巍，高丹丹，許興路，于玲，王楊，解謙

1.哈爾濱工業大學附屬黑龍江省醫院放射免疫特檢科，黑龍江哈爾濱 150036；2.哈爾濱市紅十字中心醫院檢驗科，黑龍江哈爾濱 150036；3.哈爾濱工業大學附屬黑龍江省醫院實驗診斷部，黑龍江哈爾濱 150036；4.哈爾濱工業大學附屬黑龍江省醫院兒科，黑龍江哈爾濱 150036

結直腸癌屬于臨床常見的消化系統惡性腫瘤，近年來，受環境問題、人口老齡化加重等因素的影響，結直腸癌發病率不斷升高[1-2]。手術為結直腸癌的根治手段，能夠祛除病灶，降低腫瘤病灶復發風險以及轉移風險，對于延長患者生存周期具有非常重要的意義，但是中晚期結直腸癌患者需要配合放化療等手段以進一步提高病情控制效果并有效延長患者生存周期，早期準確診斷和治療對于改善患者生存質量有重要意義[3-4]。Doublecortin樣激酶-1（Doublecortin Like Disease 1, DCLK1）屬于Doublecortin家族及蛋白激酶家族成員。研究表明，DCLK1在結直腸細胞系中存在癌癥干細胞樣特征，與病情進展及預后存在重要關聯[5]。本研究選取2018年7月—2022年6月哈爾濱工業大學附屬黑龍江省立醫院收治的73例結直腸癌患者作為研究對象，分析DCLK1單克隆抗體在結直腸癌中的表達情況以及與患者預后相關性，以期為臨床評估患者病情嚴重程度以及預測患者預后提供指導，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的73例結直腸癌患者作為研究對象，其中男44例，女29例；年齡27～79歲，平均（60.16±5.04）歲。根據患者腫瘤組織中DCLK1表達水平將其分為DCLK1低表達組與DCLK1高表達組，分別納入例數為31例、42例。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者與家屬知情同意（SYYLLBA202161）。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①經纖維結腸鏡檢查及病理活檢確診病情；②具有非常完整的臨床資料；③術前未接受過化療、放療等治療；④年齡>18歲。

排除標準：①處于妊娠期、哺乳期女性患者；②合并其他惡性病變或者系統性疾病患者；③伴精神、智力、理解或者溝通能力障礙患者；④DCLK1檢測結果不明確或者無法對檢測結果進行準確判定患者。

1.3 方法

腫瘤組織中DCLK1單克隆抗體檢測方法如下：針對結直腸癌石蠟切片實施脫蠟，直至脫水，以乙醇實施梯度脫水。切片染色通過Harris蘇木素進行，時間為3～8 min，然后于自來水下沖洗，采用1%鹽酸乙醇進行分化，數秒后以自來水進行沖洗，返藍操作通過0.6%氨水實施，返藍完成后在流水下沖洗。切片應用伊紅染液對切片實施持續染色（1～3 min），脫水后實施封片操作，通過乙醇取得梯度脫水效果。將切片稍晾干，然后脫水封片，封片采用中性樹膠，在顯微鏡下讀片后拍照。將直徑為4 μm的結直腸癌組織切片以石蠟包埋，烤片1 h，然后在室溫狀態下放置，連續浸泡15 min。通過羅氏全自動免疫組化儀上實施切片運動，程序如下：脫蠟15 min后通過抗原修復緩沖液使pH至8.5，然后持續修復30 min，以血清實施封閉（15 min），將一抗100 μl滴入其中，在37℃溫度下連續孵育30 min，通過二抗孵育，時間為20 min，然后DAB，時間為6 min，蘇木素3 min，返藍液3 min。對切片進行梯度乙醇脫水，然后實施干燥及二甲苯透明，通過中性樹膠封片，在顯微鏡下讀片并拍照。觀察細胞質顏色，若可見棕黃色或者黃色即為染色。無染色計0分，輕微染色計1分，中度染色計2分，強染色計算3分。如下為染色面積評估標準：無染色計0分；染色細胞占0%～＜30%計1分；染色細胞占30%～＜60%計2分；染色細胞≥60%計3分。最終得分即為染色深淺得分×染色面積得分，以評分>4分為高表達。

1.4 觀察指標

①分析腫瘤組織中DCLK1表達水平與結直腸癌患者病理特征，包括患者的年齡、性別、腫瘤分期（Tumor Node Metastasis, TNM）分期、淋巴結轉移、腫瘤直徑、浸潤深度、有無脈管、是否出現腫瘤病灶遠處轉移以及腫瘤分化程度。

②分析腫瘤組織中DCLK1表達水平影響因素。

1.5 統計方法

采用SPSS 23.0統計學軟件分析數據，腫瘤組織中DCLK1表達水平與結直腸癌患者病理特征為計數資料，以例數（n）和率（%）表示，進行χ2檢驗。篩選影響腫瘤組織中DCLK1高表達水平的相關因素，選擇單因素分析中P＜0.05的變量進行多因素Logistic回歸分析，計算相對危險度（OR）和95%可信區間（95%CI）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組織中DCLK1表達水平與結直腸癌患者病理特征分析

DCLK1高表達患者共計42例，DCLK1低表達患者共計31例，DCLK1高表達組與DCLK1低表達組患者年齡、性別對比，差異無統計學意義（P均＞0.05）；兩組患者腫瘤直徑、腫瘤組織TNM分期、浸潤深度、淋巴結是否轉移、有無脈管、腫瘤分化程度、腫瘤病灶是否遠處轉移對比，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 腫瘤組織中DCLK1表達水平與結直腸癌患者病理特征分析[n(%)]

2.2 腫瘤組織中DCLK1高表達水平影響因素分析

以DCLK1高表達組與DCLK1低表達組具有統計學意義的單因素為因變量，腫瘤組織中DCLK1高表達水平為自變量實施多因素Logistic回歸分析。研究結果顯示，腫瘤組織中DCLK1高表達水平影響因素包括TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤病灶遠處轉移、腫瘤直徑、浸潤深度、腫瘤分化程度（P均＜0.05）。見表2。

表2 腫瘤組織中DCLK1表達水平影響因素分析

3 討論

結直腸癌與人們生活方式和飲食結構等因素存在關聯，結直腸癌發生率呈升高趨勢，現階段，結直腸癌診治水平已經獲得了顯著的進步，患者生存周期獲得了延長，但是患者預后以及遠期生存率仍然不佳。侵入性內徑檢查聯合病理活檢為臨床診斷結直腸癌的主要手段，但是作為有創性檢查，上述檢查方式應用受限，因此，有必要需求輔助性診斷手段以提高結直腸癌檢出率。

腫瘤干細胞在腫瘤發生、發展以及轉移和復發中發揮著至關重要的作用，癌癥的治療過程中如不能使癌癥干細胞得到有效清除，癌癥很容易發生復發和轉移。DCLK1可作為腫瘤干細胞的特異性表面標志物，開發抗DCLK1特異性抗體對于腫瘤干細胞的特異性診斷和治療具有重要的意義。人類染色體13q13上可見DCLK1編碼基因，乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等組織上皮細胞的基質和細胞質中均可檢出DCLK1，不但與腫瘤病灶轉移存在關聯，同時也會影響患者預后。結直腸癌細胞系中DCLK1存在癌癥干細胞樣特征，表明DCLK1在結直腸癌早期診斷具有一定的價值，可對腫瘤復發及預后等相關情況進行預測[6-7]。

結直腸癌在全世界范圍內均屬于高度病態疾病及致命性疾病，盡管P53、KRAS及APC等多種致癌基因與腫瘤抑制基因被發現，但是受低頻率體細胞突變等因素的影響，導致結腸癌存在異質性，此外，受潛在功能突變等因素的影響，結腸癌臨床完全治愈率極低，嚴重危及患者生命安全[8]。部分大腸癌可通過子代組成細胞表型變異，干細胞存在為癌癥發生和進展的重要原因，在結直腸癌增殖與轉移過程中均能夠發揮重要的驅動作用。腫瘤干細胞可產生其他腫瘤細胞，DCLK1為腫瘤干細胞標志，可通過抑制腫瘤生長的微小RNA（miRNA）及Let-7a含量增加，進而可使促進腫瘤發生的上皮間質轉化及腫瘤干細胞基因的轉錄因子表達降低[9]。

DCLK1在神經元遷移、神經元凋亡、神經元逆性運輸及凋亡等過程中均可發揮作用，其微管聚合活動能不受其他蛋白激酶活性的影響，DCLK1在鈣信號通路控制發育中的大腦神經元遷移過程中以及成熟神經系統發揮過程中可能發揮了一定的參與作用[10-11]。與正常人結腸黏膜相比，結直腸癌患者DCLK1表達水平顯著升高。DCLK1為存在于癌癥及正常干細胞中的蛋白質，可通過原癌基因c-Myc基因及pri-let-7a miRNA基因的調控作用促進腫瘤發生和發展。腫瘤干細胞可生成其他腫瘤細胞，與親代細胞相比，腫瘤干細胞的能力顯著更強。腫瘤干細胞中的DCLK1上調可能與細胞增殖能力顯著增強存在關聯[12]。本研究中，多因素Logistic回歸分析研究結果表明，腫瘤組織中DCLK1高表達水平影響因素包括浸潤深度、淋巴結轉移、腫瘤病灶遠處轉移、TNM分期、腫瘤直徑、腫瘤分化程度（P均＜0.05）。

現階段，臨床關于DCLK1在腫瘤發展重要環節中所發揮的重要作用尚缺乏了解，DCLK1表達上調在結直腸腫瘤中可能為早期事件，高DCLK1表達不但能夠于原發性腫瘤中檢出，同時也能夠于遠端轉移中檢出[13]。DCLK1在結直腸癌、食管癌以及胰腺癌等多種腫瘤細胞中表達水平較高，而且與腫瘤生長、侵襲以及轉移等存在密切關聯，TNM分期、浸潤深度以及淋巴結轉移、腫瘤病灶遠處轉移、腫瘤分化程度等指標均能夠反映腫瘤生長和侵襲情況，DCLK1可對腫瘤細胞凋亡相關蛋白表達發揮調控作用，對結直腸腫瘤凋亡可產生影響，同時也會影響化療敏感度。賈長河等[14]研究發現，DCLK1在胃癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織，DCLK1高表達與胃癌患者臨床分期、淋巴轉移、脈管侵犯、神經侵犯以及腫瘤浸潤程度、分化程度存在相關性。

綜上所述，腫瘤組織中DCLK1高表達水平影響因素較多，包括淋巴結轉移、浸潤深度、TNM分期、腫瘤直徑、腫瘤病灶遠處轉移、腫瘤分化程度等，臨床可根據相關影響因素對DCLK1單克隆抗體表達水平進行判斷。本研究的局限性主要包括樣本量少和研究時間短等，未來應在條件允許的情況下增加樣本量并延長研究時間以深入驗證和分析DCLK1單克隆抗體在結腸癌中的表達情況，以期為臨床評估患者病情與預后提供一定的指導。