獲得性免疫在干眼的啟動與維持

孫文鑫,郭俞利,劉祖國,3

0引言

干眼(dry eye,DE)是多因素引起的慢性眼表疾病,是由淚液的質、量及動力學異常導致的淚膜不穩定或眼表微環境失衡,可伴有眼表炎癥反應,組織損傷及神經異常,造成眼部多種不適癥狀,嚴重時可引起視功能障礙[1]。目前,我國按照淚液的主要成分和淚液動力學因素將干眼分為5類,分別是水液缺乏型干眼、脂質異常型干眼、黏蛋白異常型干眼、淚液動力學異常型干眼及混合型干眼[2]。既往研究表明,DE是一種炎癥性疾病,與自身免疫性疾病有許多共同特征。相關基礎研究表明,干眼是眼表的非感染性炎癥[3]。環境因素、內源性應激和抗原等應激反應被認為是DE的觸發機制。眼表免疫系統被激活,免疫細胞浸潤到眼表組織,分泌多種免疫分子造成眼表炎癥反應,加劇眼表損傷。本文就干眼的免疫機制研究進展進行綜述并重點討論獲得性免疫在DE的啟動與維持。

1天然免疫

角膜上皮細胞位于眼表的最外層,并與環境直接接觸[4]。長期暴露于多種環境應激下引起淚膜不穩定性增加最終導致眼表高滲狀態,引起角膜上皮細胞損傷和天然免疫炎癥反應發生,最終導致眼表疾病[5]。環GMP-AMP合成酶(cGAS)刺激因子(STING)通路是近年來通過識別細胞質DNA發現的一種炎癥信號通路[6-7]。在各種應激條件下,來自細胞核和線粒體的DNA釋放到細胞質中[8],cGAS識別細胞質雙鏈DNA(dsDNA)并產生稱為2’3’-cGAMP的第二信使,該信使進一步激活STING的表達和易位,誘導TBK1(p-TBK1)和IRF3(p-IRF3)磷酸化,進一步介導下游炎癥細胞因子(IFN-a/β和CXCL10)的釋放[9]。我們團隊的最新研究發現,高滲應激(HS)介導線粒體DNA釋放到細胞質中可能通過cGAS-STING信號通路引起炎癥。這項研究提供了線粒體DNA感應激活cGAS-STING信號通路的證據,該通路在兩個實驗性干眼模型(BAC誘導的小鼠眼表損傷模型和手術摘除淚腺的干眼小鼠模型),干眼患者樣本以及暴露于HS培養的HCE中介導眼表炎癥反應[10]。這一研究證實了角膜上皮細胞在DE炎癥反應啟動中的新作用,這一與天然免疫反應相關的信號通路的識別,可能成為DE潛在的治療靶點。此外,眼表的高滲狀態早期通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)應激信號通路,啟動一系列反應破壞角膜上皮細胞屏障功能。產生的活性氧(ROS)抑制了磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號轉導[11],導致眼表上皮細胞受損或死亡,同時通過Toll樣受體4(TLR4)、Nod樣受體蛋白-3(NLRP3)炎癥小體等向天然免疫細胞傳遞炎癥信號,產生炎癥因子導致眼表炎癥[12]。大量研究表明,干眼狀態下淚液和角膜組織中炎癥細胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等表達水平增高[13]。

干眼導致眼表組織發生損傷后,角膜上皮細胞首先啟動了免疫炎癥反應,隨后眼表的中性粒細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等先后活化,這些天然免疫細胞的活化,一方面擴大了眼表炎癥級聯反應,造成眼表損傷;另一方面促進了自身反應性T細胞的活化與分化,激活獲得性免疫反應。T細胞活化后又可以分泌多種炎癥因子和趨化因子繼續促進天然免疫反應的發生,形成惡性循環(圖1)。因此,了解DE發生發展時的病理過程有助于為DE的治療提供新靶點。

2獲得性免疫

獲得性免疫(acquired immunity)是指體內抗原特異性T/B淋巴細胞接受抗原刺激后,自身活化、增殖、分化為效應細胞,產生一系列生物學效應的全過程(圖2)。根據參與免疫應答細胞種類及其機制的不同,可將獲得性免疫反應分為B細胞介導的體液免疫應答和T細胞介導的細胞免疫應答兩種類型[14]。T細胞是不均一的細胞群體,根據其表面標志及功能特點,可分為不同的T細胞類別及其亞群。在本篇綜述中,我們根據T細胞抗原受體(TCR)分類將T細胞分為TCRαβT細胞和TCRγδT細胞,并分別介紹這兩類T細胞介導的免疫反應在DE病理中的作用。

2.1TCRαβT細胞細胞免疫是人體免疫系統的重要組成部分,在清除癌變組織和病原體入侵中發揮重要作用。在既往臨床和基礎研究中觀察到DE患者和小鼠結膜中有T細胞的浸潤,提示T細胞參與了干眼的病理過程[15],但具體的T細胞亞群特征及功能有待闡明。近期一項研究特異性地分離了DE小鼠的結膜,并通過高通量TCR測序來揭示DE發生時的TCR序列。與對照組小鼠相比,干眼小鼠結膜αβT細胞受體(αβTCR)的α鏈和β鏈克隆型明顯增加。TCRα鏈和β鏈的互補決定區3區(CDR3)氨基酸長度較健康對照組顯著增多[16]。αβT細胞亞群占T細胞群體的65%-70%,其表面的TCRs由α鏈和β鏈兩條糖蛋白鏈組成,具有主要組織相容性復合物(MHC)介導的特異性識別抗原細胞毒功能[17]。該研究進一步證實了DE是一種主要由T細胞介導的自身免疫性疾病,αβT細胞亞群參與了DE的發展并為DE的治療提供了新靶點。

目前關于DE獲得性免疫應答的研究主要集中在CD4+T細胞。T細胞在眼表浸潤的場所主要為結膜。CD4+T細胞可以通過淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)黏附在眼表組織中并促進DE炎癥發生現已成為DE的治療靶點[18]。一項來自新加坡的臨床研究對健康個體和DE患者結膜樣本中的T細胞進行了分析,研究者通過收集結膜印記細胞學樣本對來自健康供體的T細胞進行分析發現CD8+T細胞對CD4+T細胞具有明顯的優勢[19]。此外,研究還發現健康人的結膜中含CD8+/CD69+/CD103+/CCR7-T淋巴細胞。利用一系列T細胞特異性的表面標記物,研究者進一步分析了52例DE患者眼表存在的不同T細胞亞群。根據特異性標記物,可以將這些DE患者分為兩種類型：第一類DE患者有較高的眼紅發生率,結膜中CD8+T細胞的數量明顯升高;第二類DE患者的淚膜不穩定性增加,結膜中CD4+T細胞的比例更高,研究結果表明大部分患者屬于第二類。因此,與健康眼部組織樣本中的T細胞相比,DE發生時T細胞群的再分配導致了其發病機制的復雜性[19]。近期的一項基礎研究評估了CD4+T細胞在苯扎氯銨(BAC)誘導的C57BL/6小鼠眼表損傷中的致病作用。研究結果表明,與正常組相比,通過BAC誘導可以引起CD4+CD69+,CD4+IFN-γ+和CD4+IL-17+細胞數量增加,并且伴有IFN-γ、IL-17、Th1、Th17以及轉錄因子T-bet和RORγt的增加。此外,BAC還可以引起眼表損傷,包括角膜屏障功能受損,結膜杯狀細胞丟失和淚液生成減少。從BAC誘導的小鼠體內特異性地分離出CD4+T細胞并過繼轉接到裸鼠體內,可導致與直接局部BAC處理相似的眼表表現,具體包括了CD4+T細胞、IFN-γ、IL-17的增加以及眼表損傷[20]。干燥綜合征相關DE(ssDE)發生時伴有淚腺、結膜和瞼板腺上皮細胞的自身免疫性炎癥反應,并且產生的CD8+T細胞可以通過穿孔素-顆粒酶途徑破壞角膜上皮[21]。由此可見,深入研究CD4+T細胞和CD8+T細胞在DE發生發展中的具體作用,對于DE免疫炎癥方面的治療具有重要指導意義。

輔助性T細胞17(T helper cell 17,Th17)是一種能夠分泌白介素17(interleukin17,IL-17)的T細胞亞群,在自身免疫性疾病和機體防御反應中具有重要的意義。Th17細胞在淋巴組織中分化擴增后遷移到眼表并釋放炎癥細胞因子發揮致病作用,引起角膜和結膜上皮細胞凋亡,瞼板腺基底腺泡細胞增殖和脂質生成異常,以及神經退行性改變[22]。隨著急性期的消退,記憶性Th17細胞持續產生的IL-17可維持DE發生時眼表慢性炎癥反應,局部阻斷IL-17可顯著緩解DE癥狀[23]。Th17細胞除了可以直接引起眼表組織損傷外,還可以通過放大炎癥反應介導DE病理過程導致惡性循環,IL-17可以有效地誘導內皮細胞和上皮細胞分泌IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-8,引起眼表炎癥級聯反應,進一步招募中性粒細胞和巨噬細胞并激活抗原提呈細胞(antigenpresenting cells,APCs)[24]。在由過敏性疾病導致的瞼板腺功能障礙的小鼠模型中發現Th17細胞介導的中性粒細胞向結膜聚集,在導致瞼板腺阻塞中起核心作用,阻斷Th17細胞免疫反應可以顯著減少瞼板腺阻塞的發生[25]。同時APCs和CD4+T細胞通過免疫突觸在淋巴結中相互作用,產生大量促炎細胞因子,刺激CD4+T細胞分化為不同類型的T細胞亞群。Th17產生的粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)主要通過促進眼表APCs的成熟和遷移促進DE眼表炎癥反應,有研究表明DE發生時淚液中GM-CSF水平升高[26]。此外,免疫系統也會隨著年齡的增長而發生著各種變化,導致全身各個系統慢性低水平炎癥狀態和自身免疫的風險增加[27]。由于DE在中老年患者中更為普遍和嚴重。因此可以推測Th17細胞免疫反應的發生和衰老之間具有密切的聯系。同時有研究發現隨著年齡的增長,Th17細胞免疫反應增強[28]。Th17細胞一方面從淋巴組織遷移到眼表發揮致病作用,另一方面通過參與角膜淋巴管生成促進APCs從眼表運輸到引流淋巴組織激活免疫反應,同時還可以促進生發中心的形成,誘導B細胞增殖,因此具有高度致病性。

圖1 天然免疫在DE病理發展中的作用(本圖由Figdraw繪制)。

圖2 獲得性免疫在DE病理發展中的作用(本圖由Figdraw繪制)。

調節性T細胞(regulatory T cell,Treg細胞)作為眼表微環境的重要組成部分,可以通過多種機制抑制免疫炎癥反應的形成。Treg細胞在誘導機體免疫耐受,調節機體免疫平衡方面起著重要作用。Treg細胞免疫防御功能受損或數量減少會破壞眼表免疫穩態進而引起多種眼表疾病。近年來,越來越多的研究證據表明,Treg細胞相關免疫療法在DE治療中具有潛力。有研究發現,增加淚腺中趨化因子CCL22的局部釋放來誘導內源性Treg細胞聚集可以有效減少淋巴組織中CD4+T細胞的浸潤,減少角膜上皮熒光素鈉染色,增加淚液分泌和結膜杯狀細胞數量。局部增加功能正常的Treg細胞數量改善免疫失衡可以有效減輕實驗性動物干眼模型中免疫炎癥反應的發生,從而緩解DE相關眼表癥狀[29]。此外,靜脈注射色素上皮衍生因子(PEDF)和間充質干細胞及其外泌體療法可以抑制Th17細胞并促進Treg細胞增殖,增強免疫抑制功能,減輕DE嚴重程度[30]。由此可見,Treg細胞參與了獲得性免疫反應,并在DE病理進展中發揮重要作用。

2.2TCRγδT細胞γδT細胞是T細胞的一個亞群,占外周血液T細胞總數的5%以下,主要分布在皮膚、小腸、食管、肺、生殖器及皮下組織,是皮膚表皮內淋巴細胞和黏膜組織上皮內淋巴細胞的主要成分之一[31-33]。γδT細胞雖然具有T細胞表面受體,但在功能上主要參與天然免疫反應,可以不受MHC限制而識別多肽抗原和磷酸鹽抗原[34]。研究表明,γδT細胞是病毒感染早期受累器官中的重要細胞因素,在中樞神經系統(腦膜炎)和腸道(結膜炎)等自身免疫性疾病的炎癥中扮演重要角色[35]。γδT細胞作為重要的效應性T細胞,目前對其生物學意義的認識尚處于起始階段。既往研究表明：Th17細胞在IL-17A介導的干眼免疫發病機制中發揮主要作用。陳蔚教授團隊近期研究發現,正常小鼠結膜中分泌IL-17A的細胞分群中,高達近60%的細胞是γδT細胞;同時結膜中γδT細胞比例與干眼的嚴重程度呈正相關;消除γδT細胞后,干眼小鼠眼表癥狀減輕[36]。該研究評估了人類和實驗性小鼠DE中γδT細胞介導的炎癥反應,并強調了靶向IL-17和γδT細胞在DE治療中的潛在協同作用。

2.3B淋巴細胞B淋巴細胞簡稱B細胞,是由骨髓中的造血干細胞分化發育而來。B細胞在抗原刺激下可分化為漿細胞,在免疫監控和應對病原體入侵中扮演著核心角色[37]。為了維持眼表穩態,位于眼表的漿細胞可以不斷地釋放分泌性IgA,成為黏膜保護中最重要的體液成分之一。同時IgA還可以限制眼部微生物群侵入到深層組織。B細胞已被用于研究自身免疫性來源的眼部疾病,包括干燥綜合征[38]和葡萄膜炎[39]。使用抗CD20抗體耗竭B細胞已被用于眼部疾病的治療,這表明B細胞參與了自身免疫性疾病的發生與發展,但在DE免疫調節機制中的具體作用目前還沒有明確的共識。

3小結與展望

眼部組織中包含了大量的免疫細胞,分布在眼表的免疫細胞維持了微環境的穩態,從而避免了不必要的組織損傷。近期有研究探討了免疫炎癥反應在DE中的作用,并重點討論了DE、炎癥和瞼板腺功能障礙之間的惡性循環關系[40]。另外有針對DE發生的早期階段進行的研究,發現神經肽在DE炎癥中發揮著關鍵作用,通過抑制神經肽可能防止DE的惡化和進展[41]。上述研究對于DE的發病機制提出了新見解,但均沒有對DE發生發展的全過程進行詳細的描述。在本篇綜述,我們描述了DE發生時眼表免疫反應的激活過程：當眼表的微環境穩態被破壞時,按照發生免疫炎癥反應的時間順序,角膜上皮細胞首先啟動天然免疫反應,隨后激活中性粒細胞、巨噬細胞等免疫細胞參與眼表損傷。當刺激因素持續存在或再次發生時,便開始啟動獲得性免疫引起T細胞和B細胞的聚集以及大量炎癥因子的產生最終導致DE。在DE診療中,區分DE所處的免疫反應階段對于DE的用藥方案具有指導意義。對于輕度DE患者,主要采用物理治療改善環境條件以減少天然免疫反應的發生,如減少屏幕使用時間、停止使用高氣流風扇以及滴加人工淚液等。中度至重度DE患者則需要進行抗炎和免疫抑制等多靶點聯合治療減輕獲得性免疫反應引起的眼表損傷。此外,免疫反應在DE病理進展的分子基礎、標記物發掘、診斷試劑盒開發及相應階段的治療藥物靶點研究是未來具有前景的研究方向。