外泌體在眼科應用的研究進展

王麗娜,孫豐源

0引言

1967年,Wolf[1]在血漿中發現了細胞外囊泡,當時認為這是血小板廢物。1984年,Johnstone等[2]在培養的綿羊紅細胞上清液中發現了外泌體,認為它們是轉鐵蛋白受體的排泄通道。自此,外泌體的概念被首次正式提出。1996年,Raposo等[3]發現外泌體可以改變細胞外微環境,提供抗原,刺激T細胞增殖,誘導免疫應答,影響健康,因此被認為是免疫疫苗。2007年,Valadi等[4]首次證實外泌體中mRNA和miRNA具有生物活性。外泌體由不同的細胞產生和釋放,在各種生物學過程中發揮作用,如免疫調節、凝血、細胞增殖、分化和遷移以及信息傳遞。2013年,諾貝爾生理學或醫學獎授予J. E. Rothman,R. W. Schekman和T. C. Sudhof,以獎勵這三位科學家闡明了細胞囊泡運輸和傳輸的分子機制。2015年,Huan等[5]發現,急性骨髓性白血病的外泌體抑制白血病骨髓微環境中的造血干細胞,從而引發了對外泌體在干細胞和癌細胞功能的廣泛研究。眼睛是一個獨特的視覺感覺器官,有一個透明的屈光系統,其中充滿了眼內液體,包括房水和玻璃體液。除了支撐眼球壁,它們還為眼組織提供營養。許多疾病可以改變房水和玻璃體的含量。近年來,越來越多的研究表明,外泌體也在眼科疾病的發生與發展中扮演了重要角色,具有重要意義和潛在的臨床應用價值。現就外泌體的基本生物學概況和在眼科的相關研究進行綜述。

1外泌體的生物學特征

外泌體的生物學特性起源于細胞膜的內陷,形成細胞內囊泡;被內吞作用包裹形成早期的內吞體,并選擇性地吸收細胞質中的蛋白質,脂質和RNA最終形成晚期的內吞體——多泡體(multivesicular body, MVB)。一些微生物可被溶酶體吞噬和降解,而其他的則與細胞膜融合并釋放到細胞外液中。這些囊泡具有不同的類型,根據其直徑分類：外泌體(30-150 nm),凋亡小體(800-5 000 nm)和微泡(100-1 000 nm)。外泌體是微米級的雙層磷脂膜囊泡,其形狀(杯狀或扁球形),大小均勻,存在于體液中。外泌體是從多種細胞釋放出來的,如上皮細胞、內皮細胞、神經元、樹突狀細胞、肥大細胞、淋巴細胞和血小板。此外,還可以從細胞培養基中提取外泌體。外泌體與其他類型的囊泡本質上是不同的,因為它們的組成更加復雜,而且來自不同細胞的外泌體內容物也不同。外泌體三個主要內容物是蛋白質、脂質和核酸[6]。外泌體將這些內容物運輸到靶細胞,促進細胞間的通訊。在外泌體中發現的蛋白質包括非特異性和特異性蛋白質,大部分為非特異性蛋白質,這些非特異性蛋白質參與外泌體的形成,決定其結構,并維持基本的細胞功能。外泌體還富含多種脂質,包括膽固醇、鞘磷脂、磷酸甘油酸、神經酰胺和飽和脂肪酸。飽和磷脂的內在剛性在維持外泌體的形態和穩定性方面起著重要作用。此外,在外泌體中存在各種mRNA,miRNA,lncRNA,環狀RNA和其他非編碼RNA (ncRNA)[7]。外泌體作為有效的載體,將RNA轉運到靶細胞,調節蛋白質合成和細胞功能。

2外泌體在眼科疾病的應用機制

2.1眼表Hu等[8]使用同位素標記,結合液相色譜串聯質譜法,分析患者的翼狀胬肉組織和結膜成纖維細胞。共鑒定出433種蛋白,其中外泌體蛋白135種,提示外泌體蛋白在翼狀胬肉的發病機制中起重要作用。角膜緣干細胞缺損是多種角膜病變的病理特征。傳統的治療方法包括角膜緣干細胞(limbal stem cell, LSC)移植、口腔黏膜上皮移植和多能干細胞移植。然而,除了在治療過程中獲得捐贈來源的困難之外,還存在許多技術和倫理方面的限制。細胞微環境包括旁分泌因子,直接影響LSC的存活和再生。因此,評估外泌體在角膜再生中的作用,利用外泌體轉運一些特殊的蛋白質將有助于LSC缺損的治療。Han等[9]證實了人和小鼠角膜上皮細胞中存在外泌體,發現小鼠角膜上皮細胞分泌的外泌體與基質細胞融合并誘導成纖維細胞轉化。角膜上皮的外泌體參與角膜修復和新生血管生成。因此,外泌體可用于治療角膜疾病。基質金屬蛋白酶14(MMP14)促進新生血管生成。角膜成纖維細胞分泌含有活化的MMP14的外泌體。這些外泌體被血管內皮細胞吸收,MMP14通過外泌體從角膜成纖維細胞轉運到血管內皮細胞,角膜新生血管的治療提供了一個新的靶點。Jangamreddy等[10]發現一種肽類似物作為膠原蛋白的替代物通過刺激生長的角膜上皮細胞分泌細胞外囊泡(extracellular vesicles, EV)以產生基質成分來促進角膜組織的再生。此外,發現來自正常人角膜緣角化細胞的外泌體可能通過激活Akt信號傳導而大大增強原代角膜緣上皮細胞的增殖和傷口愈合速率[11]。最近的一項研究表明,人類角膜間充質干細胞外泌體(mesenchymal stem cell exosomes,MSCExos)能夠加速角膜上皮的傷口愈合[12]。現有的結果表明,外泌體是重要的再生生物介質[13],為角膜損傷和移植排斥反應提供新的治療策略。人角膜上皮細胞(human corneal epithelial cells,HCECs)、體外巨噬細胞和體內角膜上皮均成功地攝取了染色的間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)的外泌體。人類間充質干細胞外泌體表達CD9,CD63和CD81并加速角膜上皮傷口愈合[14]。在角膜損傷的情況下,許多內源性間充質干細胞在血液中被動員起來,并通過快速促進再生和組織修復在受損角膜中發揮特定作用。MSC衍生的外泌體在大鼠角膜移植排斥反應模型通過抑制Th1信號通路,有效延長移植物存活時間[15]。此外,由于外泌體的穩定性、低免疫原性和毒性,長半衰期,能通過血腦屏障等優點,可在干眼的治療中發揮重要作用。

2.2青光眼外泌體在房水(aqueous humor,AH)發病機制中的作用。外泌體攜帶miR-486-5p,miR-204和miR-184,并且這些miRNA參與AH流動[16]。肌球蛋白(Myocilin)是一種分泌蛋白,突變時會提高眼壓。大約3%-4%的原發性開角型青光眼病例與肌球蛋白有關[17]。Myocilin參與細胞外轉運的機制尚不清楚。Lerner等[18]在原發性開角型青光眼患者的小梁網(trabecular meshwork, TM)組織中發現了483個差異表達基因。在483個基因中,發現了36個外泌體成分基因,提示外泌體轉運異常可能與原發性開角型青光眼的發病有關。非色素性睫狀上皮(non-pigmented ciliary epithelium,nPCE)衍生的外泌體也通過調節TM細胞中的經典Wnt信號傳導途徑參與眼壓的調節。此外,Wnt信號轉導的負調節因子,如miR-29b在nPCE外泌體中含量豐富[19]。來自未成熟小膠質細胞的外泌體促進促炎細胞因子的合成,提高吞噬效率,并在眼內壓增加時產生活性氧以改變視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells, RGCs)的數量[20]。非TM細胞被認為可以通過外泌體間接調節眼壓。因此,眼壓可以通過調節青光眼患者的TM和非TM來源的外泌體來控制。RGCs及其軸突的缺失導致了青光眼所致的失明。MSC分泌外泌體有助于將miRNA遞送到附近的細胞,隨后提高RGCs的存活率和軸突的再生,并部分阻止RGCs軸突的喪失和RGCs功能障礙[21]。基質干細胞衍生的外泌體能顯著提高視網膜缺血小鼠的功能恢復,減少神經炎癥和細胞凋亡。由于它們的納米尺寸,外泌體可以迅速到達RGCs,為它們提供神經營養蛋白[22]。此外,來自臍帶間充質干細胞的外泌體也刺激視網膜神經節細胞存活和膠質細胞活化,或可用于異型治療[23]。與其他給藥途徑相比,外泌體療法具有高效、穩定、持久的特點,MSC分泌的外泌體可能成為青光眼的無細胞治療途徑之一。

2.3年齡相關性黃斑變性早期年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)的發病機制與脂質和蛋白質在視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)層下的積聚有關,導致Bruch膜增厚和不連續的RPE沉積物(drusen)的形成。據報道,RPE細胞中膜補體調節劑的減少導致ARMD中RPE的損傷,并且其水平的降低可以通過其釋放的凋亡顆粒和外泌體來解釋[24]。來自RPE細胞的外泌體受到視網膜中侵入的白細胞的攻擊,這可能導致外泌體膜的不穩定,細胞內蛋白質的釋放,促成了drusen的形成[25]。這意味著RPE細胞衍生的外泌體部分負責補體驅動的ARMD先天性免疫反應。Kang等[26]從ARMD患者房水中分離出外泌體,提取其蛋白質,用定量蛋白質組學方法鑒定,并與對照組進行比較。發現6種蛋白,包括主動脈平滑肌蛋白、肌球蛋白-9、熱休克蛋白70、組織蛋白酶D、細胞角蛋白8和細胞角蛋白14。可以作為ARMD的診斷生物標志物和治療靶點。去水晶蛋白D可以幫助抵抗視網膜色素上皮氧化應激和ARMD。Kannan等[27]證實,這種晶體蛋白可以通過外泌體轉運到鄰近的RPE和感光細胞,起到保護作用。He等[28]發現,在氧化應激誘導后,更多的外泌體從RPE中釋放出來。當提取外泌體蛋白質時,它們表現出血管內皮生長因子受體的高表達。此外,當分離的外泌體與內皮細胞共培養時,它們顯著增強了內皮細胞的血管化能力。ARMD的病理過程一度被認為是純粹的退行性疾病,逐漸認識到,外泌體的免疫調節參與了視網膜炎癥和纖維化的病理過程。Knickelbein等[29]發現源自炎癥因子刺激的RPE的外泌體可以殺死單核細胞,介導局部免疫應答。外泌體可以將抗炎藥物轉運到小膠質細胞,抑制神經炎癥反應,并在感光細胞中發揮神經保護作用。外泌體在缺血性視網膜病變的發病機制中也起到保護作用。Moisseieev等[30]將間充質干細胞衍生的外泌體注射到氧化應激誘導的小鼠的玻璃體腔中,發現新血管生成面積顯著減少,表明外泌體在缺血性視網膜病變中具有保護作用。在滲出性ARMD,特別是在脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)膜中,視網膜星形膠質細胞來源的外泌體被證實可靶向巨噬細胞和血管內皮細胞,并對激光誘導的小鼠模型的視網膜血管滲漏和CNV有顯著的抑制作用[31]。

2.4葡萄膜黑色素瘤Ragusa等[32]分離并鑒定了來自葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)患者玻璃體液和血清中分離出的147個miRNA。在這147種miRNA中,來自UM患者的玻璃體液、血清和組織的外泌體中的miR-146a上調,表明外泌體中的miR-146a可能是UM的潛在診斷標志物。這項研究還表明,源自體液或組織的外泌體提供了與源自眼內組織液的外泌體相似的診斷信息,使得診斷更簡單和更方便。來自腫瘤細胞的外泌體促進了類似葡萄膜的微環境的形成,并增強UM特異性的轉移。此外,它們可以在玻璃體內流動,從而促進細胞間的交流。此外,VH外泌體表明UM進展的可能性。例如,miR-21和miR-146a在VH外泌體中被上調[33],在CM的外泌體中也發現了黑色素細胞[34]。因此,VH中的外泌體可以作為一種診斷標志,并為進一步了解UM的發病機制提供新的思路。

2.5視網膜母細胞瘤視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是最常見的原發性兒童眼內惡性腫瘤,占所有兒童惡性腫瘤的4%。占所有小兒惡性腫瘤的4%[35]。一個正確的VH外泌體的正確檢測可以幫助診斷和早期檢測RB的進展。在最近的研究中,觀察到RB腫瘤組織和玻璃體液(retinoblastoma of vitreous seeding,RBVS)[36]中的外泌體蛋白特性。在RBVS外泌體中,存在與侵襲和轉移有關的蛋白,如細胞膜重塑和相互作用蛋白以及葡萄糖和氨基酸的代謝/分解蛋白質。因此,外泌體生物標志物被認為是診斷RB的選擇之一。

2.6眼外傷Yu等[37]建立了激光誘導的視網膜損傷的小鼠模型。來源于間充質干細胞的外泌體通過玻璃體內注射被引入。這些外泌體能顯著下調單核細胞趨化蛋白1的表達,有效抑制激光損傷引起的炎癥反應。Mead等[38]建立了視神經挫傷動物模型,并將間充質干細胞來源的外泌體注入玻璃體腔。視網膜神經節細胞存活率顯著提高,細胞功能恢復,神經節細胞軸突丟失率顯著降低。這些結果表明,來源于間充質干細胞的外泌體在創傷性神經細胞損傷中起保護作用。

2.7免疫介導的眼部疾病自身免疫性葡萄膜炎是葡萄膜(虹膜,睫狀體和脈絡膜組織)甚至鄰近組織(玻璃體,視神經和視網膜)的炎癥,可以單獨或繼發于全身綜合征。自身免疫的原因主要是由于致病性T細胞介導的不適當的免疫應答[39]。致病性Th17細胞及其相關炎性細胞因子協同作為炎癥的有效誘導劑[40]。Knickelbein等[41]報道,靜息和細胞因子刺激的RPE細胞釋放的外泌體抑制從非感染性葡萄膜炎患者外周血分離的T淋巴細胞的增殖,并且這些囊泡也可以調節人單核細胞表型和活力。上述結果表明,外泌體可能是RPE細胞發揮免疫調節作用的重要因素。進一步了解來自RPE細胞的外泌體可能揭示葡萄膜炎治療的新前景。外泌體在葡萄膜炎的主要機制是調節性T細胞群的不平衡,人視網膜上皮[例如成人視網膜色素上皮(ARPE-19)細胞系]的外泌體抑制T細胞刺激和有害的炎癥反應。Vogt-Koyanagi-Harada綜合征是一種常見的自身免疫性葡萄膜炎。患者的血漿外泌體含有許多與炎癥程度相關的蛋白質,特別是碳水化合物酶2和RAS相關蛋白RAP-1B水平升高,可用作Vogt-Koyanagi-Harada病患者活動性炎癥的生物標志物[42]。來自間充質干細胞的外泌體阻止EAU的發展并抑制小鼠模型中Th1和Th17細胞的表達[43]。間充質干細胞分泌的外泌體通過減少炎癥細胞的遷移而有效地改善葡萄膜炎,這為葡萄膜炎的治療提供了新的視角。然而,沒有觀察到MSC外泌體對感光受體間視黃醇結合蛋白(photoreceptor Retinol binding protein,PRBP)特異性T細胞增殖的抑制作用。此外,外泌體可以通過存在于角膜緣的新型基質細胞(telocytes,TC)遞送到虹膜基質中的其他細胞[44]。在另一項研究中,調節性B細胞產生含有IL-35的外泌體。在EAU模型中,用這些含有IL-35的外泌體處理的小鼠具有較低的EAU評分和較少的視力障礙,并且疾病預防與分泌IL-10和IL-35的Treg細胞的擴增有關,同時抑制Th17細胞應答[45]。IL-35-Bregs釋放的外泌體可能有助于治療自身免疫性葡萄膜炎。

3外泌體作為藥物載體的研究

隨著外泌體特異性分離技術及其蛋白質和核酸含量鑒定方法的發展,外泌體生物標志物在眼病研究中具有廣闊的應用前景。局部滴眼液具有局限性,例如需要頻繁給藥和低生物利用度。近年來,人們開發了各種合成藥物載體,用于現有藥物,以提高治療效果。然而,令人不安的問題,包括它們的免疫毒性和單核吞噬細胞系統(mononuclear phagocyte system,MPS)或網狀內皮系統(reticuloendothelial system,RES)的快速清除仍然存在。幸運的是,被認為是天然納米載體的外泌體具有許多藥物運載工具應該具有的非常理想的特性。這些小囊泡能夠穿透血腦屏障(BBB),在人工修飾后將其穿過細胞膜并靶向定位到特定的細胞類型[46]。總的來說,外泌體已被證明可以作為功能性RNAstrands(mRNA,miRNA,siRNA和lncRNA),DNA分子,肽或合成藥物的納米載體[47]。例如,來自產生腺相關病毒2型(AAV-2)的293T細胞的外泌體在玻璃體內注射后顯示出比常規AAV-2更高的視網膜轉導效率,并被認為是玻璃體內基因轉移到視網膜的強大工具[48]。此外,據報道,裝載外源性miRNA-126的MSC-Exos通過抑制高遷移率族蛋白1(HMGB1)信號通路來減輕高血糖誘導的視網膜炎癥[49]。此外,化療藥物負載的外泌體顯示出更高的療效和更好的生物利用度[50],這對眼部藥物治療有新的啟示。到目前為止,對外源性功能載體負載外泌體在眼科疾病中的潛在作用的研究還很少。因此,在眼科領域開發這樣的治療方法需要付出巨大的努力。

4小結

綜上所述,外泌體具有多種功能,參與細胞間通訊、免疫調節、病毒感染、組織再生以及腫瘤的發生、發展和轉移。由于眼科疾病患者血清和房水中外泌體特異性含量的相對穩定性和特異性,這些分子有望成為新的生物標志物。外泌體在眼科疾病中的作用尚不清楚,首先,由于眼內液的體積有限,開發一種能夠分離出高純度、完整和高效的外泌體的方案是進一步研究眼內液的先決條件,目前還沒有關于外泌體在晶狀體相關疾病、眼眶炎癥或腫瘤病變中的作用和應用的研究。外泌體可以轉運其內容物,在不同的病理生理條件下有差異表達,并在多種體液中表現出同源性,然而,具有這些不同表面分子和含量的外泌體迫切需要一種系統、合理的分離和分類方法。目前,由于成本和技術問題,很難分離出大量純化的和特異性的外泌體。在某些情況下,少數功能性外泌體亞型被大量非功能性細胞外囊泡所覆蓋[51]。因此,如何區分高純度外泌體亞型,明確命名這些亞型,并研究其功能是今后研究的主要方向。盡管還存在許多問題,但外泌體已成為一個極具潛力的新的研究熱點,外泌體可能成為眼科研究和臨床治療的有效工具,在眼科疾病的診斷和治療中發揮重要作用。