NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎中的研究進展

周 敏,胡秋明

0引言

葡萄膜炎是一組累及虹膜、睫狀體、玻璃體、視網膜、脈絡膜為主的炎癥疾病總稱,是世界范圍內致盲眼病之一。炎癥反應在葡萄膜炎的發生和發展中起著關鍵作用,其病因復雜,發病與細菌、病毒以及自身免疫性疾病密切相關[1]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體是一種細胞內多聚體蛋白復合物,它在炎癥和免疫反應中起著重要作用。NLRP3炎癥小體可識別外源性病菌入侵和內源性細胞損傷的危險信號,激活、調控炎癥反應,抵抗感染與應激損傷,但其過度激活則會導致組織的炎癥損傷[2-3]。目前,國內外已經有大量實驗表明,NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎發病機制中發揮著重要的調控作用。因此,通過研究NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎中的作用,深入了解其在疾病發展過程中的具體機制,通過干預NLRP3炎癥小體的活性,調節炎癥反應的程度,從而減輕葡萄膜炎的癥狀和病情,這將為開發新的治療思路和新藥物提供方向,也為葡萄膜炎的基礎研究和臨床治療新靶點提供重要的意義。本文將綜述其相關的研究進展。

1 NLRP3炎癥小體

核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族是一個重要的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs),當識別微生物成分中的病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMPs)、損傷相關分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMPs)等時,由內源性應激產生,觸發下游炎癥通路,以消除微生物感染和修復受損組織。NLRs家族蛋白含有共同的特征性結構：C端富含亮氨酸重復結構域(leucine-rich repeat,LRR)、中心核苷酸結合結構域(nucleotide-binding oligomerization domain,NBD)及N端蛋白-蛋白作用結構域(pyrin-like domain,PYD),其中具有可變性的PYD是NLRs家族蛋白不同亞型的區分標志[4]。炎癥小體主要為Nod樣受體家族含pyrin結構域蛋白(Nod-like receptor family pyrin domain-containing protein,NLRP),目前在葡萄膜疾病中研究最廣泛且最深入的是NLRP3炎癥小體。

1.1NLRP3炎癥小體的結構及功能NLRP3作為先天免疫系統中的重要傳感器,通過形成NLRP3炎癥小體,激活caspase-1的超分子復合物來監測外源性病原體入侵和內源性細胞損傷并做出反應。NLRP3炎癥小體由3個主要成分構成：Nod樣受體蛋白3(NLRP3)、細胞凋亡相關的微粒蛋白(ASC)以及半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)。NLRP3是一個感受器蛋白,它能夠感知細胞內的多種刺激信號,包括感染、細胞應激、氧化應激和細胞損傷等,能捕獲危險信號并啟動下游免疫。ASC是一個適配蛋白,它能夠連接NLRP3和caspase-1,從而促進炎癥小體的形成和活化。caspase-1是一個重要的炎癥介導酶,能夠切割和激活多種炎癥因子,誘導細胞因子白細胞介素(IL)-1β和IL-18的成熟;或通過膜穿孔蛋白D(gasdermin-D,GSDMD)活化誘導細胞焦亡[5-6]。

PRRs啟動的天然免疫應答是機體抵御病原體入侵、維持內環境穩態的第一道防線[3,7]。NLRP3是細胞質中重要的PRR,同樣具有3個結構域：LRR結構域、中心核苷酸結合域(NACHT)以及含有CARD的凋亡相關顆粒蛋白(ASC)的氨基端熱蛋白結構域(PYD)。LRR結構域主要介導蛋白與蛋白之間的相互作用,還參與維持NLRP3的穩定性：生理條件下,NACHT與LRR結合使NLRP3炎癥小體處于抑制狀態。NACHT結構域具有結合核苷酸和水解ATP的能力,激活后,能通過ATP依賴的自身寡聚化,產生PYD相互作用,進一步招募連接蛋白ASC。PYD通常以同型方式相互作用,調控下游信號[8]。

ASC包含N端PYD和C端caspase募集結構域(CARD)。它通過同型PYD-PYD相互作用被招募到寡聚化的NLRP3分子的簇狀PYD上,形成ASC有核細絲。這些有核細絲聚集ASC的C端CARDs,作為連接效應分子caspase-1的平臺[9-11]。caspase-1由N端的CARD、大的催化亞基p20和C端的小的催化亞基p10組成[12]。激活后的caspase-1能夠切割并激活負責細胞焦亡的gasdermin D(GSDMD)[13-14],并將IL-1、IL-18促炎細胞因子裂解為成熟的促炎細胞因子,對調節免疫反應至關重要[15-17]。

1.2NLRP3炎癥小體的激活NLRP3炎癥小體的激活受到嚴格的調控,其激活機制極其復雜。迄今為止,研究表明NLRP3炎癥小體可通過3種不同的信號通路被激活。

1.2.1經典NLRP3炎癥小體激活途徑經典激活途徑需要兩個步驟：“啟動”和“激活”。首先,NLRP3通過識別PAMPs或DAMPs參與免疫和炎癥反應的細胞因子來啟動。在啟動階段,Toll樣受體、細胞因子受體或NLRs的配體可以誘導轉錄因子NF-κB的激活,促進NLRP3和pro-IL-1β的表達[18]。當“啟動”NLRP3后,通過引起離子流(如K+外排[19]、Cl-外排[20]、Na+內流[21]、Ca2+信號失調[22]等)、線粒體功能障礙、活性氧(reactive oxygen species,ROS)和線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的釋放[23-25]、溶酶體破裂和反式高爾基體解聚[26]等多種分子和細胞途徑,從而激活炎癥小體。

1.2.2非經典NLRP3炎癥小體激活途徑研究表明,NLRP3炎癥小體激活還存在一條caspase-11(人體內caspase-4和caspase-5)依賴的非經典NLRP3炎癥小體信號通路[27-29]。在小鼠巨噬細胞中,啟動信號對于非經典炎癥小體的激活是必不可少的,然而在表達caspase-4的人類細胞中,啟動信號對于非經典的NLRP3炎癥小體激活并不是必需的[30-31]。最近的研究表明,當革蘭氏陰性菌感染后,干擾素誘導蛋白IRGB10以鳥苷酸結合蛋白(GBP)依賴的方式直接靶向細菌的細胞膜,破壞細菌結構完整性,并將配體LPS和類脂A釋放到細胞質中[32-33]。LPS和類脂A可直接結合鼠源caspase-11的CARD結構域或人源caspase-4和caspase-5,導致caspase寡聚化和自溶[30],而活化的caspase-4/5/11蛋白可水解小鼠gasdermin D(GSDMD)的Asp276 (人GSDMD的Asp275)位點,釋放N端結構域,與胞膜上的心磷脂、磷脂酰肌醇磷酸酯和磷脂酰絲氨酸結合,誘導孔道形成和細胞焦亡[14,34]。

1.2.3選擇性NLRP3炎癥小體激活途徑新的研究還發現了另一種的NLRP3炎癥小體激活途徑,即選擇性NLRP3炎癥小體途徑。在該途徑中,單獨的TLR配體不足以激活caspase-1或誘導人和豬單核細胞中IL-1β的成熟和分泌[35]。選擇性通路需要通過上游的TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CASP8信號通路激活,也需要NLRP3-ASC-caspase-1信號,但這種新的炎癥小體缺乏經典途徑和非經典途徑相關特征。有研究表明,載脂蛋白C3(ApoC3)能激活人單核細胞中caspase-8依賴的選擇性NLRP3炎癥小體。ApoC3能通過TLR-SCIMP-Lyn-Syk-TRPM2軸與Tlr2和Tlr4相互作用誘導其異源二聚化,進而促進Ca2+內流、ROS產生、NADPH氧化酶和caspase-8活化[36-37],但caspase-8與NLRP3炎癥小體激活以及作用機制還需要進一步的研究與探索。

2葡萄膜炎

2.1流行病學及現狀葡萄膜炎是一組累及虹膜、睫狀體、脈絡膜、葡萄膜、視網膜、視網膜血管以及玻璃體的眼部炎癥性疾病,其引起的眼部并發癥包括并發性白內障、滲出性視網膜脫離、視神經萎縮、青光眼等,是造成視力損害和失明的重要原因[38-42]。當前,未能及時治愈的葡萄膜炎嚴重威脅著患者的視力健康。在全球,5%-10%的視力損害由葡萄膜炎引起,據統計,葡萄膜炎在發達國家的發病率約為(17-52)/100000人年,患病率為(38-714)/100000人[43-44]。

2.2葡萄膜炎癥性質的分類按炎癥的性質,葡萄膜炎可分為感染性與非感染性。感染性葡萄膜炎主要與細菌、病毒、結核、弓形蟲、寄生蟲等因素有關;而非感染性葡萄膜炎主要與自身免疫有關,一般會合并有全身免疫性疾病,如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、銀屑病、多發性硬化等[1]。

3 NLRP3炎癥小體與葡萄膜炎

3.1NLRP3炎癥小體與Behcet病Behcet病(BD)是一種以口腔、生殖器、葡萄膜、皮膚等多種組織的動靜脈同時受累的慢性、復發性炎癥為特征的全身多系統自身免疫性疾病[45]。目前對該疾病的發病機制尚不完全清楚,但研究表明,NLRP3炎癥小體在Behcet病的發展中起到重要作用。Eun-So Lee團隊檢測了15例活動期、15例穩定期BD患者和15例健康志愿者的外周血單個核細胞(PBMCs),與健康對照組相比,BD患者的NLRP3炎癥小體在mRNA和蛋白水平上表達均顯著增加[46]。其中25例伴有結節性紅斑患者中NLRP3和ASC的表達增加明顯。眾所周知,IL-1β是一種獨特的促炎癥細胞因子,是自身炎癥性疾病的基礎[47]。IL-1β可通過TLR2/4和ROS-NLRP3炎癥小體依賴途徑,觸發肽聚糖和脂多糖參與Behcet病的發病[48]。在?z?ren的一項研究中,將Behcet病的患者分為血管型、皮膚黏膜型和眼部損害型,實驗研究顯示：血管型受累的BD患者在LPS刺激后IL-1β和TNF-α水平高于眼部受累型、皮膚黏膜受累的BD患者和健康對照者[49]。同時,這項研究也表明了不同類型BD患者之間細胞因子分泌譜可能存在差異,揭示不同類型的BD存在不同的發病機制。使用人源化的抗IL-1β抗體XOMA 052治療患有急性眼內炎癥的BD患者,7例受治療的患者炎癥均減輕[50],這也證明了IL-1β在BD發病機制中確實發揮著重要的作用。而IL-1β作為NLRP3炎癥小體通路中分泌的重要炎癥細胞因子,這也表明未來有望通過下調NLRP3炎癥小體抑制IL-1β分泌從而減輕BD的炎癥反應。在Tüzün團隊的研究中還分析并探討了5例伴隨有神經癥狀的Behcet病(NBD)患者在發作期和緩解期的外周血單個核細胞(PBMC)樣本,使用實時熒光定量PCR檢測發現了DEFA1B和NLRP3蛋白基因表達顯著上調[51]。同時,又在Hamzaoui等[52]的研究中得到證實,檢測伴有神經癥狀的NBD患者的腦脊液和血清分析發現IL-32和NLRP3炎癥小體在NBD患者中表達增加。NLRP3炎癥小體可能是IL-32釋放的重要介質,是潛在的治療靶點。在BD治療方面,一項RCT實驗研究了關于補鋅對BD病患者NLRP3炎癥小體的調控作用。在50例BD患者中發現,3 mo的葡萄糖酸鋅補充(30 mg/d)對白細胞中NLRP3和caspase-1基因的表達明顯降低,并有效緩解了BD患者的炎性癥狀[53]。基于以上研究也表明,在未來,調控NLRP3炎癥小體有望成為Behcet病治療的有效新靶點。

3.2NLRP3炎癥小體與Vogt-小柳原田綜合征Vogt-小柳原田綜合征(VKH)是一種自身免疫性疾病,以雙側肉芽腫性全葡萄膜炎為特征,全身受累包括白發癥、白癜風、脫發、中樞神經系統和聽覺障礙等。其發病病因以及機制尚不完全清楚,可能與病毒感染以及免疫反應有關,但具體的機制并不是很明確[54-55]。在Liang等[56]的研究中,VKH患者在細胞中也發現了異常的炎癥小體的激活,這些患者單核細胞來源的巨噬細胞(MDMs)產生IL-1β和ROS水平升高,下調NLRP3或抑制ROS均可抑制IL-1β的產生。因此,NLRP3的活化水平升高提示該炎癥小體在VKH綜合征發病機制中發揮著作用。然而,目前對于NLRP3炎癥小體在VKH中的作用和治療潛力的研究仍然缺乏,需要進行更多的實驗研究和臨床試驗來進一步驗證NLRP3炎癥小體在VKH中的作用,并開發出更有效的治療策略。

3.3NLRP3炎癥小體與內毒素誘導的葡萄膜炎在眼表疾病以及眼前段炎癥中,NLRP3炎癥小體也發揮著重要的作用[57]。人類急性前葡萄膜炎(acute anterior uveitis,AAU)的研究模型主要以內毒素誘導葡萄膜炎(endotoxin-induced uveitis,EIU)動物模型為主,它不是一種自身免疫過程,而是由注射細菌內毒素脂多糖類(LPS)觸發。在模型中,注射LPS(皮下或腹腔注射)后,在24 h內可以觀察到快速但短暫的前葡萄膜炎[58-60]。該模型對于研究急性眼部炎癥感染過程的各個方面以及不同的治療干預措施非常有用。Rosenzweig等[61]通過采用免疫印跡法檢測NLRP3、ASC和caspase-1的表達,酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測IL-1β水平發現了：NLRP3、ASC和caspase-1蛋白在眼組織中呈組成性表達,在EIU過程中,IL-1β蛋白產生增加,而且這需要caspase-1和NLRP3的共同存在。然而,敲除caspase-1或NLRP3基因的大鼠并沒改變EIU的嚴重程度。Lei等報道了一種新型抗炎小分子VVN001能有效抑制NLRP3炎癥小體的激活,減輕EIU小鼠炎癥反應[62]。Ildefonso等[63]也研究了一種來自黏液瘤病毒的M013免疫調節蛋白。在EIU中,該蛋白能干擾NLRP3炎癥小體和NF-κB在內的促炎信號通路,明顯減少玻璃體內炎癥細胞的數量和顯著降低IL-1β的濃度。目前,NLRP3炎癥小體和EIU之間的具體作用機制仍然還不明確,這也是一個備受關注的研究領域。探索NLRP3炎癥小體在EIU中的激活途徑以及其作用機制對于該疾病的發病機制和尋找新的治療方法具有重要意義。

3.4NLRP3炎癥小體與實驗性自身免疫性葡萄膜炎實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)是一種人類內源性葡萄膜炎的動物模型,是通過視網膜S抗原(solubleanti-gen,S-Ag)、視網膜光感受器間維生素A類結合蛋白(interphotoreceptor retinoin-binding protein,IRBP)、視紫紅質等自身抗原誘導EAU產生[58]。病變部位主要位于視網膜、葡萄膜,是常用的人類非感染性葡萄膜炎的模型,與人類的交感性眼炎、VKH和眼結節病等有相似的臨床特點和病理特征[64]。Kumar等[65]檢測了補體膜攻擊復合物(MAC)和NLRP3炎癥小體在正常和不能組裝補體膜攻擊復合物的C9/小鼠EAU發病機制中的作用。實驗中發現MAC是EAU中NLRP3炎癥小體活化和IL-1β產生的重要調節因子。相反,MAC和NLRP3炎癥小體在C9/小鼠中沒有升高,更出乎意料的是,MAC的抑制劑sCD59的遞送成功地減弱了NLRP3炎癥小體的激活和減輕了EAU病理反應。雖然,NLRP3炎癥小體的作用在葡萄膜炎的發生發展中已被證實,但機制并不明確,更多的研究者在探討其機制及調控通路。侯圣平的研究團隊證實了NLRP3可通過調控P-SIK1/SREBF1通路抑制AIM2炎癥小體介導的EAU,并突顯了靶向NLRP3的治療潛力[66]。樹突狀細胞(DCs)是抗原呈遞細胞,通過分泌IL-18和IL-1β參與T細胞活化和葡萄膜炎的致病過程。魏琳團隊在EAU模型DC中發現可溶性CD83(sCD83)與GTP酶Ras相關蛋白(Rab1a)可相互作用,促進Rab1a在自噬溶酶體中積累,并抑制mTORC1磷酸化和NLRP3表達。沉默Rab1a可降低活化DCs中NLRP3的表達,而Rab1aQ70L過表達能夠恢復sCD83誘導的活化DCs中NLRP3的表達[67]。這為研究NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎中的作用機制提供了新思路。

4結語

綜上所述,本文通過闡明NLRP3炎癥小體的結構、生物學功能、激活通路以及其與不同類型的葡萄膜炎相關機制方面的研究,發現了NLRP3炎癥小體在人類葡萄膜炎和動物模型的葡萄膜炎中的異常活性,下調NLRP3炎癥小體活性能有效緩解葡萄膜炎的炎癥反應,但其詳細的分子機制尚不明確。目前,葡萄膜炎的治療主要依靠抗炎藥物和免疫抑制劑等,但這些治療方法存在一定的局限性,未來可以通過深入研究NLRP3炎癥小體的激活、信號傳導途徑以及與其他細胞因子的相互作用,進一步明確NLRP3炎癥小體在葡萄膜炎中的具體作用機制,并有望通過調控NLRP3炎癥小體的激活通路上的相關炎性因子、基因和蛋白的表達,成為葡萄膜炎基礎研究的新方向和臨床治療的新靶點。