m6A甲基化修飾在眼科疾病中的研究進展

薛愚愚,劉春夢 ,陳 婕,葉河江

0引言

N6-甲基腺苷 (m6A)甲基化修飾是真核生物RNA最普遍的一種表觀遺傳學修飾,以動態、可逆的方式參與調控多種生物學過程。m6A可調節多種細胞功能,參與代謝性、炎癥性、退行性眼病和眼部腫瘤的發生發展,如糖尿病視網膜病變、白內障、年齡相關性黃斑變性、葡萄膜黑色素瘤等。本文對m6A甲基化修飾在眼部組織細胞和眼科疾病中的作用、分子機制和治療前景進行綜述。

1 m6A甲基化修飾概述

隨著檢測技術的快速發展,RNA表觀遺傳學已成為前沿研究領域[1]。核堿基的化學修飾對于誘導蛋白質翻譯和調節某些信號通路至關重要[2]。在這些修飾中,近年來備受關注的是RNA的m6A甲基化修飾。

m6A甲基化修飾,即腺嘌呤堿基A的第6位N原子發生甲基化,是最普遍、最豐富和最保守的RNA內部修飾方式[3-5]。m6A修飾各種RNA,包括信使RNA (mRNA)、微小RNA (miRNA)和長鏈非編碼RNA (lncRNA)[2, 6]。m6A修飾具有可逆性,在調節基因表達時,這種修飾更具靈活性[3, 7]。

RNA的m6A甲基化修飾主要有三類酶參與,即m6A甲基轉移酶、m6A去甲基化酶和m6A甲基化識別蛋白。m6A甲基轉移酶(又稱“writers”),負責促進RNA甲基化,包括METTL3/14/16、RBM15/15B、WTAP和KIAA1429等。其中研究較多的是METTL3,它是第一個被發現的甲基轉移酶,在m6A甲基化修飾過程中起主要的催化作用,能使特定的靶轉錄物甲基化。m6A去甲基化酶(又稱“erasers”),負責將細胞中的RNA去甲基化,包括FTO和ALKBH5。m6A甲基化識別蛋白(又稱“readers”),主要識別存在于RNA中的m6A修飾并調節下游分子機制,包括YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、IGF2BP1/2/3和HNRNPA2B1等[7-8]。這些酶使m6A修飾過程動態和可逆,敲除或過表達這些酶可以特異性干擾m6A的形成[9]。RNA的編碼器和消碼器決定了RNA的m6A修飾水平,而讀碼器決定了m6A修飾的RNA翻譯效率或影響RNA的穩定性[10]。

m6A修飾在腫瘤和非腫瘤疾病的發病機制中都具有調節作用[5, 11]。異常的m6A甲基化可以影響某些生物學過程并導致多種疾病,如癌癥、糖尿病等[12]。近年來的研究發現,m6A甲基化異常可能介導眼部的多種病理過程,參與代謝性、炎癥性、退行性眼病和眼部腫瘤的發生發展。

2 m6A甲基化修飾與眼部組織細胞的關系

m6A甲基化修飾的表達可見于許多眼組織,包括角膜、葡萄膜、晶狀體、視網膜和眼外肌等[10]。了解眼組織細胞中m6A甲基化修飾的作用可為了解眼部功能和眼部疾病的分子機制提供新的見解。

2.1視網膜神經節細胞Weng等[13]的研究發現m6A甲基轉移酶METTL14被敲除后,小鼠視網膜神經節的軸突再生會減弱。METTL14在哺乳動物神經系統軸突再生中起作用,但具體的作用途徑還不清楚。另一項研究[14]揭示了功能冗余的YTHDFs介導皮質和視網膜神經發生中的m6A調節過程。視網膜中METTL14敲除會導致視網膜神經元數量減少,層狀結構紊亂。這種表型只有在視網膜中的YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3同時被敲除時才會出現。未來的研究需要明確YTHDFs通過何種機制調節神經細胞,以闡明YTHDFs靶點在神經發生中的具體功能。

2.2視網膜小膠質細胞小膠質細胞是視網膜中的組織駐留巨噬細胞,其誘導的視網膜炎癥的不平衡極化是糖尿病視網膜病變(diabetes retinopathy,DR)和葡萄膜炎的發病機制之一。Chen等[15]研究鑒定出一個負調控小膠質細胞M1極化的關鍵分子A20。在葡萄糖刺激下,ALKBH5的低表達使m6A修飾水平升高,A20 mRNA的降解速度加快,最終導致A20在DR視網膜小膠質細胞中的表達降低,小膠質細胞M1極化增強,炎癥反應更明顯。研究有助于闡釋DR的發病機制。另一項研究[16]分析了葡萄膜炎小鼠視網膜細胞的單細胞RNA測序數據,YTHDC1沉默下調SIRT1的表達,促進STAT3磷酸化,進而誘導M1小膠質細胞激活并加劇炎癥反應。研究探索了YTHDC1在細胞免疫調節中的作用,但在體內是否有同樣的作用還有待進一步研究。

2.3視網膜色素上皮細胞Yin等[17]檢測到METTL14沉默可降低人類視網膜色素上皮細胞(adult retinal pigment epithelial cell line-19,ARPE-19)的增殖,增加細胞凋亡。METTL14調節微管相關蛋白(microtubule-associated protein,MAP2)的表達,MAP2可與NEUROD1結合,導致RPE細胞的病理變化。研究提示針對METTL14/YTHDF2/MAP2/NEUROD1信號軸的治療策略可能是一種新的有效選擇。Meng等[18]探討了METTL3在脂多糖(LPS)誘導的RPE炎癥中的作用和潛在機制。METTL3沉默后,RPE細胞表現出增殖抑制和炎癥因子分泌增加。METTL3經NR2F1/IL-6途徑調節RPE炎癥。研究為治療RPE相關的眼部疾病提供了新的思路。

2.4視網膜的光感受器Yang等[19]研究了METTL14在視網膜視桿細胞和視錐細胞中的功能。視桿細胞中METTL14的缺失會導致暗視覺功能下降和視桿細胞變性,而視錐細胞中METTL14的缺失會導致視蛋白的錯誤定位和視錐細胞進行性死亡。研究首次證明了m6A對于維持哺乳動物視網膜光感受器的存活和功能的重要性,可能為RP的治療干預提供新的見解。

2.5血管內皮細胞最近的一項研究表明METTL3介導的m6A甲基化修飾在脈絡膜新生血管發病中可經Notch通路調控血管內皮細胞的生物學活性,促進血管形成[20]。研究為CNV發病的分子機制提供了新的見解,但還需體內實驗作進一步驗證。Zhao等[21]發現內皮細胞CYP2J2過表達維持了缺血再灌注損傷后BRB的完整性。研究提示CYP2J2-METTL3-ANXA1通路是緩解BRB損傷的潛在治療靶點。

表1總結了m6A甲基化在視網膜細胞調節中的重要性,m6A調節因子可能成為新的治療靶點。然而,單純的細胞研究主要集中在視網膜細胞和血管內皮細胞,目前關于眼部其他細胞的相關研究報道尚少。未來還需要更多的研究繼續闡明m6A在眼部組織細胞中的作用機制。

3 m6A甲基化修飾與眼科疾病的關系

3.1糖尿病視網膜病變研究人員在DR發病機制的幾種關鍵因素中觀察到m6A水平的變化,如炎癥、氧化應激和血管生成[22]。m6A RNA修飾可能成為控制DR進展的新的候選者。

通過鑒定并驗證DR中與RNA甲基化修飾相關的差異表達基因,研究者建議對METTL3、Nsun4等基因進行探索[23]。有多項研究證明了METTL3從不同路徑影響DR的進展。高血糖會損害內皮細胞的功能,并促進內皮-間質轉化(endothelial-mesenchymal transition,EndoMT)。Cao等[24]發現DR患者、DR小鼠和高糖誘導的人類視網膜微血管內皮細胞中METTL3的表達水平顯著下調,并證明了METTL3可通過lncRNA SNHG7/KHSRP/MKL1軸調控DR中的EndoMT,這可能成為DR治療的新靶點。也有研究基于體內和體外實驗證明了METTL3在周細胞功能障礙中的作用,發現METTL3過表達通過抑制PKC-η、FAT4和PDGFRA的表達損害周細胞功能[25],研究為DR的治療提供了新的視角。Zha等[26]臨床研究表明,與正常志愿者相比,糖尿病患者的外周靜脈血樣本中METTL3 mRNA和miR-25-3p均呈低表達,研究證明了METTL3過表達可減輕高糖誘導的RPE細胞凋亡和焦亡,并通過靶向作用于miR-25-3p/PTEN/AKT信號通路促進細胞增殖。本研究可為臨床探索DR治療的潛在藥物提供啟示。

YTHDF2是另一個重要的影響DR病理的m6A相關酶。Huang等[27]的研究表明circFAT1通過介導YTHDF2

表1 m6A相關酶在眼部組織細胞中的作用

在DR中的表達,促進HG誘導的RPE細胞自噬,抑制RPE細胞焦亡。本研究為DR的防治提供了新的思路。另一項研究[28]探討了賴氨酸乙酰轉移酶1(lysine acetyltransferase 1,KAT1)觸發YTHDF2介導的整合素β1(integrin β1,ITGB1)mRNA不穩定性以減輕DR的進展。這些分子的異常表達可為DR提供診斷或預后價值。

以上研究表明,除了mRNA之外的各種非編碼RNA,如miRNA、lncRNA和circRNA也與DR相關。m6A甲基化修飾調節了DR發病機制的不同關鍵因素,可能在DR的發病和進展中發揮關鍵作用。此領域的廣泛研究可能為DR的研究帶來新的前沿。

3.2眼部腫瘤近年來,越來越多的資料表明m6A甲基化修飾參與了各種腫瘤的發病過程。在眼部的相關研究主要涉及眼部黑色素瘤和視網膜母細胞瘤。

3.2.1眼部黑色素瘤眼部黑色素瘤包括葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)和結膜黑色素瘤(conjunctival melanoma,CM),是成人中最常見和致命的眼部癌癥。UM和CM都起源于黑色素細胞,并表現出侵襲性的生長模式。

有多項研究揭示了m6A甲基化修飾在眼部黑色素瘤中的作用機制。Jia等[29]研究發現RNA甲基化顯著抑制UM和CM的進展。m6A RNA修飾在轉錄后促進了HINT2的表達。而HINT2 mRNA是眼部黑色素瘤中的一種腫瘤抑制因子,YTHDF1促進了甲基化HINT2 mRNA的翻譯。研究揭示了眼部黑色素瘤中m6A甲基化的關鍵功能。整合膜糖蛋白β-分泌酶2(integral membrane glycoprotein beta-secretase 2, BACE2)在脊椎動物色素沉著和轉移性黑色素瘤中起重要作用。He等[30]的研究發現,沉默METTL3后,甲基化的BACE2 RNA顯著減少。而抑制BACE2在體外和體內均顯著阻礙腫瘤進展。研究提示m6A/BACE2/TMEM38b可能是眼部黑色素瘤的潛在治療軸。組蛋白乳酸化在M1巨噬細胞極化過程的表達調控中起重要作用。Yu等[31]的研究發現組蛋白乳酸化通過促進YTHDF2的表達促進腫瘤發生。YTHDF2識別m6A修飾的PER1和TP53 mRNA并促進它們的降解,從而加速眼黑色素瘤的腫瘤發生。PER1和TP53可能是與YTHDF2相關的關鍵候選基因,而YTHDF2可能是眼部黑色素瘤的一種新的致癌基因。組蛋白去乙?；种苿?histone deacetylation inhibitors,HDACis)在多種惡性腫瘤中顯示出令人鼓舞的結果。有研究發現,在眼部黑色素瘤中,靶向組蛋白去乙?；竿ㄟ^誘導METTL14修飾的m6A RNA甲基化來抑制腫瘤生長。HDACis通過HDAC/METTL14/FAT4軸在眼部黑色素瘤中發揮抗癌作用[32]。這些研究為腫瘤發生中表觀遺傳的調控提供了新見解。

UM是成人最常見的眼內惡性腫瘤,探索UM的分子機制并確定其生物標志物對于疾病的早期發現、診治和預后至關重要。Tang等[33]首次從TCGA數據集全面評估了UM中m6A調控基因的表達、潛在功能和預后價值,并區分了三個m6A調節因子(ALKBH5、YTHDF1和KIAA1429)的預后風險特征。研究表明m6A RNA甲基化調節因子在UM的惡性進展和早期診斷中起重要作用。另一項研究[34]證明了UM細胞和臨床標本中的METTL3和RNA m6A甲基化水平均顯著升高。METTL3介導的m6A RNA甲基化通過靶向c-Met調節UM細胞增殖、遷移和侵襲。研究首次闡明了m6A RNA修飾在UM中的功能作用和分子機制。Liu等[35]的研究探討了lncRNA共有的免疫基因在不同風險群體中的表達。YTHDF3在高危組中表達上調,可能是高危因素;RBM15B和IGF2BP2在低危組中表達上調,可能是保護因素。研究表明m6A調控因子和相關lncRNA在腫瘤微環境重塑中發揮了重要作用,但具體機制還需要進一步的探索。最近的一項研究[36]表明ALKBH5可通過FOXM1 mRNA的去甲基化誘導上皮間質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)促進UM轉移和進展。AKLBH5是UM中潛在的預后生物標志物和治療靶點。Wang等[37]研究發現五種m6A調節因子與UM患者的預后相關。其中,RBM15B被證實是UM的唯一獨立預后因素,且與UM的臨床病理特征顯著相關。本研究的結果是由生信分析產生的,還需要更多的臨床數據和實驗來證實RBM15B在UM中的預后價值。

3.2.2視網膜母細胞瘤視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是兒童常見的眼內惡性腫瘤。Zhang等[38]建立了小鼠的裸鼠皮下腫瘤模型,首次揭示了m6A的甲基化轉移酶METTL3是促進RB進展的關鍵因素。METTL3在體外和體內通過PI3K/AKT/mTOR通路促進RB的進展。研究提示METTL3是RB的致癌基因,同時可能是RB治療的潛在治療靶點。

3.3葡萄膜炎有三項研究通過小鼠實驗性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)模型模擬體內葡萄膜炎,并探索了m6A甲基化與EAU的關系。Tang等[39]的研究表明FTO敲低使ATF4的m6A水平升高,激活p-STAT3,加重炎癥反應。研究首次發現FTO在葡萄膜炎中的作用。近期的一項研究[40]證明了FTO介導的m6A修飾通過GPC4/TLR4/NF-κB信號軸調節小膠質細胞的炎癥,從而減輕EAU。研究為葡萄膜炎的潛在治療策略提供了新見解。Zhao等[41]的研究從體內和體外證明了METTL3的過表達以YTHDC2依賴的方式改善了EAU的發展,抑制了致病性Th17細胞的反應。研究為自身免疫性葡萄膜炎的治療提供了有希望的治療靶點。

3.4白內障Li等[42]探討了年齡相關性白內障(age-related cataract,ARC)m6A修飾對晶狀體上皮細胞(lens epithelium cells,LECs)病變中環狀RNA(circRNA)及相關甲基轉移酶的影響。m6A甲基轉移酶ALKBH5在皮質性ARC的LECs中顯著上調。研究從新的角度闡釋了ARC的發病機制。另一項研究[43]發現METTL3在糖尿病性白內障組織標本和高糖誘導的人晶狀體上皮細胞(human lens epithelial cells,HLECs)中上調。METTL3特異性靶向ICAM-1 30 UTR以增加mRNA的穩定性,并促進其蛋白質表達。研究為糖尿病性白內障的m6A修飾提供了新見解。

3.5青光眼Niu等[44]的研究建立了實驗性急性青光眼的小鼠模型,證明了視網膜中YTHDF2的條件性敲除可保護視網膜神經節細胞,避免發生樹突變性。未來YTHDF2可能用于治療青光眼和其他視網膜損傷引起的神經變性。最近的一項研究[45]首次評估了假性剝脫性青光眼(pseudoexfoliation glaucoma,PXG)和ARC患者房水中m6A甲基化組和基因表達譜,發現PXG組房水中m6A水平明顯高于ARC組。METTL3、YTHDC2在PXG標本中顯著上調。研究為PXG中m6A修飾的進一步深入研究奠定了基礎。

3.6Graves眼病Zhu等[46]對7例Graves眼病(Graves’ ophthalmopathy,GO)患者和5例未患GO的受試者在手術中切除的眼外肌進行了研究。發現與對照標本相比,GO患者標本中m6A水平顯著升高,ALKBH5、YTHDF2、WTAP等的表達顯著上調。研究表明靶向調節m6A甲基化的基因可能為GO提供新的治療方法。

3.7翼狀胬肉Jiang等[47]的臨床研究從24例翼狀胬肉患者中分別獲得24份翼狀胬肉組織和24份正常結膜組織,研究發現翼狀胬肉組織中m6A水平和METTL3表達均降低,m6A修飾可能通過Hippo通路促進疾病的發生發展。研究提示m6A修飾水平下降可能是翼狀胬肉發生的重要原因,但其確切機制有待進一步探索。

3.8角膜病Hu等[48]通過給小鼠接種鐮刀菌建立了真菌性角膜炎模型,無菌PBS處理的小鼠為對照組。與對照組相比,鐮刀菌處理組的角膜組織中總體m6A水平上調,METTL3的水平顯著升高。m6A修飾可能通過改變PI3K-AKT信號通路的激活狀態在真菌性角膜炎中發揮作用。研究首次表明m6A修飾可能為真菌性角膜炎提供潛在的治療靶點。另一項相似的研究[49]通過小鼠和原代角膜基質細胞建立體內和體外真菌性角膜炎模型,也證明了METTL3的下調可通過PI3K/AKT信號通路減弱角膜炎癥。

3.9近視轉移RNA衍生片段(transfer RNA-derived fragments,tRFs)是一類新型的小非編碼RNA。最近的一項研究[50]揭示了tRF-22通過調節脈絡膜血管功能在近視進展中的保護作用。tRF-22阻斷METTL3介導的Axin1或Arid1b mRNA轉錄物的m6A甲基化,使Axin1或Arid1b表達增加,從而產生對Wnt信號的抑制作用。tRF-22可作為一種新的抗血管生成因子。Wen等[51]發現相對于單純性核性白內障患者,在高度近視的核性白內障患者晶狀體前囊中,METTL14表達上調,METTL3、FTO、ALKBH5表達下調。研究首次提供了高度近視患者的完整人類晶狀體轉錄組m6A圖,為確定RNA m6A修飾在高度近視病理中的潛在功能提供了基礎。

3.10增殖性玻璃體視網膜病變增殖性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是一種難治性玻璃體視網膜纖維化疾病,RPE細胞的EMT是PVR的關鍵病理機制。Ma等[52]的研究發現METTL3的過表達可以在體外抑制ARPE-19細胞的EMT,在體內抑制PVR過程。研究首次證明mRNA的m6A甲基化修飾參與了PVR的病理過程,為PVR的臨床治療開辟了新視角。

3.11外傷性視神經病變Qu等[53]的動物研究建立了大鼠的外傷性視神經病變(traumatic optic neuropathy,TON)模型,發現TON組的METTL3、WTAP、FTO和ALKBH5的表達均上調。KEGG分析顯示m6A峰值上調與MAPK信號通路等顯著相關。研究揭示了TON早期m6A的差異表達修飾,可能為TON的機制和治療提供新的見解。

3.12年齡相關性黃斑變性Chen等[54]的研究確定了環狀RNA circSPECC1通過YTHDC1介導的m6A修飾,抵抗氧化應激損傷,維持RPE中的脂質代謝。研究提示,補充circSPECC1可能是一種有希望的治療年齡相關性黃斑變性的靶點。淀粉樣蛋白β(amyloid-β,Aβ)是年齡相關性黃斑變性中RPE變性的關鍵病理因素。近期的一項研究[55]發現FTO通過m6A去甲基化負調控PKA的表達,通過PKA/CREB信號通路減輕Aβ1-40誘導的視網膜色素上皮細胞變性。研究有助于為年齡相關性黃斑變性提出新的治療方法。Wang等[56]的研究發現在激光誘導脈絡膜新生血管的小鼠模型視網膜下纖維化過程中,METTL3在RPE細胞中上調。研究確定了METTL3-m6A-HMGA2在視網膜下纖維化和RPE細胞EMT中的表觀遺傳機制,為新生血管性年齡相關性黃斑變性繼發性視網膜下纖維化提供了新的治療靶點。

3.13原發性Sj?gren綜合征干眼Ma等[57]的橫斷面研究納入了48例原發性Sj?gren綜合征(primary Sj?gren’s syndrome,pSS)干眼患者和40例健康對照。研究發現pSS干眼患者的外周血單核細胞的m6A甲基化水平和METTL3表達均升高。m6A和METTL3的上調與pSS干眼患者血清學指標和干眼體征有關,提示METTL3可能參與了pSS干眼的發病機制,還需要進一步的體內和體外實驗來驗證和闡釋。

表2 m6A相關酶在眼科疾病中的生物學作用

續表2 m6A相關酶在眼科疾病中的生物學作用

4小結與展望

表觀遺傳學可以作為基因-環境的中介,為研究疾病發生發展機制提供新思路[58]。m6A甲基化在眼科疾病中的研究已涉及多種疾病,其中研究較多的是DR和眼部腫瘤,其他疾病的研究尚處于起步階段,見表2。未來,靶向m6A調控因子可能通過促進或抑制m6A甲基化來治療疾病,將為某些眼科疾病的患者帶來新的希望。