功能化海藻酸鈉水凝膠促骨髓間充質干細胞增殖、成軟骨向分化的研究

張琦 滕彬宏

軟骨組織因其缺乏血管和細胞含量低的特點，無法完成自我修復和重建。基于間充質干細胞治療的方法可以為軟骨組織的修復和再生提供一種新策略[1-3]。但間充質干細胞治療策略仍然面臨植入后細胞本身存活率低，或是受周圍血液和組織液的影響導致細胞流失等問題。基于組織工程化的水凝膠支架可以解決上述問題，其不僅可提供間充質干細胞生存的三維載體環境，而且可以模擬天然細胞外基質的部分特性，并具備臨床工作所需的可注射特性[4-5]。然而，傳統的組織工程水凝膠仍然無法有效調控細胞行為活性的表達，例如細胞擴增、凝聚、分化以及伴隨著基質沉淀，而這些是間充質干細胞向軟骨細胞轉變過程中必不可少的細胞行為事件[6]。越來越多的研究開始關注細胞在支架中的行為，結合生物活性信號可以促進水凝膠支架中細胞表達活性和功能[7-8]。這其中，有通過修飾活性基團改變水凝膠的功能[9]，或是將活性因子直接引入水凝膠體系中[10]，也有從空間結構入手，改變水凝膠的內部構造[11]。這些方式都可以在某些方面調控間充質干細胞的功能和活性。本研究以天然高分子材料海藻酸鈉（sodium alginate，SA）為支架主體，將生物活性多肽RGD 接枝于酰化SA（methacryloyl sodium alginate，MeSA）中，研究功能化的SA 水凝膠基質調控骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的行為活性以及成軟骨向分化的效果，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 MeSA（中國阿拉丁生化科技有限公司）；三乙醇胺（triethanolamine，TEOA）緩沖液（中國麥克林生化科技有限公司）；RGD 多肽（序列GCGYRGDSPG，杭州丹港生物科技公司）；光引發劑Irgacure 2959（美國Sigma 公司）；CCK-8 試劑盒（日本Dojindo 公司）；鬼筆環肽染色液-FITC（美國Sigma 公司）；酶標儀（美國Bio-RAD 公司）；真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器公司）；S-4800 掃描電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡（日本Nikon 公司）；小鼠單克隆抗體、兔多克隆抗體（美國Abcam 公司）；人源BMSCs、人源BMSCs 成軟骨向分化誘導培養基（蘇州賽業生物科技有限公司）；BCA 試劑盒、逆轉錄試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 MeSA 水凝膠及接枝RGD 多肽的MeSA[MeSA（RGD）]水凝膠制備 MeSA（10 g/L）與光引發劑（1 g/L）溶解于去離子水中，充分混合后，在紫外光（365 nm，1 W）照射下交聯1 min后成膠，即MeSA水凝膠。采用邁克爾加成反應，將凍干MeSA 和RGD 多肽（112 mol/g）溶解在0.2 mol/L TEOA 緩沖液（pH 8.0）中，在37 ℃下過夜反應，然后透析3 d，冷凍干燥后，-20 ℃保存，即MeSA（RGD）水凝膠。

1.3 細胞培養和傳代 BMSCs 在含10% FBS 和1%青霉素/鏈霉素的高糖DMEM 中培養，每隔1 d 更換1 次培養液。

1.4 細胞-水凝膠二維和三維培養體系構建

1.4.1 細胞-水凝膠二維培養體系構建 將水凝膠成膠于24 孔板底部，每個孔包含300 μL 的水凝膠溶液，在紫外光照射下交聯成膠。將1 mL 細胞懸液（密度為1.0×105個細胞/mL）接種于孔板底部的水凝膠基質表面。

1.4.2 細胞-水凝膠三維培養體系構建 將300 μL 的細胞-水凝膠懸液（密度為2×106個細胞/mL）滴加到24孔板底部，在紫外光照射下交聯成膠（形成細胞-水凝膠復合體）后，每孔添加2 mL培養液進行培養或者誘導。

1.5 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 形態的影響評估 用掃描電鏡觀察水凝膠表面的細胞形態。細胞在水凝膠表面培養至3 d 時，經過PBS 洗滌和多聚甲醛固定，冷凍干燥獲得樣品。樣品經過噴金20 s 后，在掃描電鏡下觀察細胞形態。細胞培養至7 d時，細胞-水凝膠復合體經過多聚甲醛固定30 min，在細胞穿孔液（0.1% Triton X-100/PBS）中打孔10 min，經PBS 洗滌后在鬼筆環肽染色液-FITC 中孵育30 min。后經PBS 充分洗滌3 次，在室溫下用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色10 min，染色后的樣品在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 增殖活性的影響評估 BMSCs 在水凝膠二維和三維培養體系中連續培養7 d，分別在培養1、3、7 d 時，采用CCK-8 試劑盒檢測細胞增殖活性。

1.7 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 成軟骨向分化的影響評估

1.7.1 軟骨形成標志物膠原蛋白Ⅱ（collagen Ⅱ，CollⅡ）和軟骨聚蛋白多糖（aggrecan，ACAN）蛋白表達定性檢測 采用免疫熒光染色法。細胞-水凝膠復合體在成軟骨分化誘導液中連續培養14 d 后，在多聚甲醛（40 g/L）中固定30 min。PBS 洗滌3 次后，在細胞穿孔液（0.1% Triton X-100/PBS）中打孔15 min。PBS 洗滌3次后，在3%（w/v）牛血清白蛋白溶液中室溫孵育2 h。經PBS 洗滌后加入一抗混合液，4 ℃冰箱孵育12 h。分別添加山羊抗兔IgG H&L（熒光強度：Alexa Fluor 488）、山羊抗小鼠IgG H&L（熒光強度：Alexa Fluor 647）的二抗（稀釋比為1∶500），在室溫黑暗中孵育2 h。最后在室溫下用DAPI 染色10 min，染色后的樣品在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7.2 Coll Ⅱ和ACAN mRNA 表達水平檢測 采用RT-PCR 法。細胞-水凝膠復合體在成軟骨分化誘導液中連續培養14 d，PBS 洗滌3 次，放置于Trizol 溶液中充分研磨提取RNA。采用逆轉錄試劑盒將提取的RNA 逆向轉錄為cDNA，通過PCR 分析儀解析軟骨形成標志物基因表達水平。實驗涉及的引物序列如下，28sr RNA：5'-CCCAGTGCTCTGAATGTCAA-3'，5'-AGTGGGAATCTCGTTCATCC-3'；Coll Ⅱ：5'-TGGACGATCAGGCGAAACC-3'，5'-GCTGCGGATGCTCTCAATCT-3'；ACAN：5'- TGCATTCCACGAAGCTAACCTT- 3'，5'-GACGCCTCGCCTTCTTGAA-3'）。將28sr RNA作為內參指標，采用2-ΔΔCt法分析目標基因表達水平。

1.7.3 Coll Ⅱ和ACAN 蛋白表達定量檢測 采用Western blot 法。細胞-水凝膠復合體在成軟骨分化誘導液中連續培養14 d，PBS 洗滌3 次，后放置于細胞裂解液中充分研磨。研磨后的溶液經離心（12 000 r/min，15 min）后獲得上清液。首先使用BCA 試劑盒測定上清液的總蛋白濃度。其次采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白，將電泳結束后的蛋白凝膠轉入至PVDF 膜上。最后PVDF 膜依次經過一抗和二抗孵育后，放置于發光成像儀內曝光顯影，Image lab 軟件分析蛋白表達水平。

1.8 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 形態影響的比較 細胞在水凝膠表面培養3 d 后，BMSCs在MeSA（RGD）水凝膠表面可以很好地鋪展和黏附，而在MeSA 水凝膠表面成獨立的球形結構，見圖1。BMSCs 在水凝膠三維培養體系中培養7 d 后，在MeSA水凝膠中的細胞呈球形并且相對獨立，而在MeSA（RGD）水凝膠內可以向基質中伸展和遷移，并出現相互聚集的現象，細胞增殖明顯，細胞和基質間的相互作用更顯著，見圖2（插頁）。

圖1 細胞在水凝膠二維培養體系培養3 d 時的形態電鏡下所見[A：在MeSA 水凝膠表面的細胞形態；B：在MeSA（RGD）水凝膠表面的細胞形態]

圖2 細胞在水凝膠三維培養體系培養7 d 時的形態電鏡下所見[A：在MeSA 水凝膠內的細胞形態；B：在MeSA（RGD）水凝膠內的細胞形態]

2.2 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 增殖活性的比較 隨著培養時間的延長，細胞增殖活性呈現上升趨勢。無論在MeSA（RGD）水凝膠二維或是三維培養體系，BMSCs 增殖活性明顯高于在MeSA 水凝膠中（均P＜0.05），見圖3。這表明，MeSA（RGD）水凝膠可以更好地促進BMSCs 的增殖活性。

圖3 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 增殖活性的比較（A：二維培養體系；B：三維培養體系）

2.3 MeSA（RGD）水凝膠與MeSA 水凝膠對BMSCs 成軟骨向分化的誘導效果比較 免疫熒光染色定性分析顯示，在MeSA（RGD）水凝膠中，BMSCs Coll Ⅱ和ACAN 的表達強度高于在MeSA 水凝膠中，同時可以觀察到在MeSA（RGD）水凝膠中BMSCs 聚集明顯，出現細胞凝聚現象，見圖4（插頁）。定量分析顯示，在Me-SA（RGD）水凝膠中，BMSCs Coll Ⅱ和ACAN 基因及蛋白表達水平高于在MeSA 水凝膠中（均P＜0.05），見圖5。這表明，MeSA（RGD）水凝膠可以更好地促進BMSCs 的成軟骨向分化。

圖4 體外培養14 d 后的細胞-水凝膠復合體激光共聚焦顯微鏡下所見

圖5 體外培養14 d 后的細胞-水凝膠復合體的軟骨相關基因mRNA 和蛋白的表達水平比較（A：ACAN mRNA 表達水平比較；B：Coll ⅡmRNA 表達水平比較；C：ACAN 和Coll Ⅱ在水凝膠基質內的蛋白表達電泳圖）

3 討論

水凝膠支架作為一種新型細胞培養體系和可注射修復材料，在近些年的組織再生領域得到廣泛的關注和研究[12-13]。以海藻酸鈉為代表的天然高分子材料，可以通過物理和化學改性，制備適用于組織工程技術的支架體系[14-16]。海藻酸鈉來源于褐色海藻，具有優良的親水性和生物相容性，其較慢的降解速度可以保證支架較長時間充填和修復目標缺損[17-18]。以往的研究表明，通過共價交聯形成的MeSA 水凝膠，可以提供一種穩定非降解的膠態結構，并且有利于細胞的生存和生長[19]。然而，天然的細胞外基質是復雜和動態的，這種穩定且高度交聯的網絡基質結構往往會限制種子細胞的遷移和增殖。同時，由于MeSA 本身缺乏與細胞接觸的位點，這也會導致種子細胞在此凝膠基質中的信號傳遞和細胞-基質相互作用受到限制[20-21]。基于此，本研究著眼于BMSCs 向軟骨分化轉變中的關鍵細胞行為，構建功能化MeSA 基質，改善基質的生物活性，用以調節關鍵細胞行為并高效促軟骨形成。

本研究首先通過邁克爾加成反應，將仿生多肽接枝于MeSA 中的雙鍵上。仿生多肽由于其結構穩定、生物相容性好以及生物學效果顯著等優點，可以賦予水凝膠額外的生物性能。以往的研究表明，RGD 多肽可以通過整合素，提供細胞作用于基質的結合位點并調控種子細胞存活和增殖，顯著改善凝膠基質微環境。Luo 等[22]研究RGD 調控BMSCs 增殖和成骨分化的實驗中，證明了離子交聯的MeSA 水凝膠通過接枝RGD 序列，可以改善細胞增殖活性。同時指出增殖活性的提高可以更好地促進成骨分化效果。Huebsch等[8]在研究三維水凝膠基質對BMSCs 分化的調控中，為了更好地模擬天然細胞外基質環境，也是首先將RGD 多肽修飾于MeSA 基質中，增強細胞與基質間的連接。同時也指出，細胞與基質間的作用力加強，是調控細胞分化的重要指標。因此，在水凝膠的設計中，增強基質與細胞間的黏附對于細胞活性的表達和細胞分化的調控至關重要。就目前的研究動態來講，仿生RGD 多肽功能化SA 在調節BMSC 成軟骨向分化中的細胞行為還鮮有報道。本實驗中，無論在二維培養體系還是三維培養體系，細胞可以與功能化基質產生更好的相互作用，細胞表現出顯著的遷移趨勢和骨架延展。在RGD 對細胞活性調控的基礎上，將細胞-水凝膠三維復合體在體外誘導培養14 d 后，功能化的水凝膠基質可以更好地調控BMSCs 的成軟骨向分化。同時，在功能化的三維培養體系內，細胞出現明顯的聚集成團現象，而BMSCs 在發育和分化過程中的聚集和凝聚現象，是軟骨形成過程中的關鍵行為特征[23]。

本研究通過將RGD 多肽接枝于MeSA 上，改善共價交聯水凝膠的基質特性，促進了BMSCs 增殖和聚集活性的表達。BMSCs 在凝膠基質中誘導培養14 d 后，軟骨形成相關的蛋白和基因表達顯著。因此，該功能化的水凝膠可以提供BMSCs 良好的生存空間和微環境，促進BMSCs 在凝膠基質中的成軟骨向分化。