黃連素在抑制幽門螺桿菌多重耐藥中的作用研究

周帆 彭君偉 徐小青 曹勤

幽門螺桿菌（helicobater pylori，Hp）是一種主要定植于人體胃黏膜的微需氧菌。Hp 感染是我國最常見的慢性感染性疾病，人群中的感染率約為50%[1]。現代醫學研究表明Hp 通過產生空泡毒素等引起細胞損傷，促進相關炎癥介質的表達引起胃黏膜慢性炎癥[2]，從而誘發多種消化道疾病，同時也是胃癌、胃黏膜相關組織淋巴瘤發生、發展的重要危險因素[3]。因此根除Hp 對于預防和治療此類疾病至關重要。自從含鉍劑的四聯方案被推薦為抗Hp 治療的一線方案以來[4]，Hp 的根除率得到了提高。然而近年來Hp 對常用抗菌藥物克拉霉素（clarithromycin，CLR）、甲硝唑（metronidazole，MTZ）、左氧氟沙星（levofloxacin，LEV）的耐藥率持續超過警戒水平，更有報道稱我國2018 至2020 年抗菌藥物的多重耐藥（multi-drμg resistant，MDR）率已高達26.5%[5]，四聯方案的療效受到嚴重影響。如何逆轉Hp 耐藥、提高Hp 的根除率成為當前臨床急需解決的難題。近年來越來越多的臨床工作者把目光投向了中醫藥，研究表明許多中藥成分有天然的抗菌活性，在治療方案中加入中藥可以提高Hp 根除率，有效改善臨床癥狀，減少西藥的不良反應[6]。文獻研究發現抗Hp 的單味中藥以清熱解毒類為主，其中黃連的體外抑菌效果明顯強于其他單藥，且為抗Hp 的中藥復方中的核心藥物[7]。而黃連的抗Hp 作用主要與其活性成分黃連素有關[8]。黃連素不僅有很強的體外抑菌作用，而且能抑制致病菌對抗菌藥物的耐藥性[9]。有研究發現CLR 耐藥Hp 菌株經黃連素作用后，其耐藥性可發生逆轉[10]，但黃連素對Hp 的MDR 株是否有相似作用國內外相關研究不多。故本研究通過體外誘導培養MDR 株來觀察黃連素抑制Hp 的MDR 株對常用抗菌藥物耐藥性的作用，以期為黃連素用于臨床抗Hp 治療提供實驗依據，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株 本實驗分離的Hp 臨床菌株均來自上海市普陀區中心醫院內鏡室2017 年9 月至2018 年10月期間行胃鏡檢查且組織活檢經尿素酶試驗檢測為陽性的患者，在中心實驗室通過體外分離培養獲得，并同時經3 種方法（形態學、過氧化氫試驗、革蘭染色）鑒定為Hp 菌落。質控菌株ATCC 43504 購自上海普盛生物科技有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 98%黃連素原藥（粉劑，規格：1 g/瓶，批號：SLBB2771V）購自美國Sigma 生物公司，意大利Liofilchem E-test 試紙條（規格：10 條/包，批號：120326）購自上海楓岳生物科技有限公司，英國OXOID 腦心浸液粉（規格：500 g/瓶，批號：2309228）、哥倫比亞瓊脂粉（規格：500 g/瓶，批號：2160231）均購自上海典森生物科技有限公司，美國Gibco 無菌FBS（規格：500 mL/瓶，批號：42Q8275K）購自上海睿安生物科技有限公司，無菌脫纖維綿羊血（規格：100 mL/瓶，上海順威生物技術有限公司），A400 型27 位多點接種儀（上海典森生物科技有限公司，型號A400-027S），三氣培養箱（賽默飛世爾科技有限公司，型號:HERAcell vios160i）。

1.3 方法

1.3.1 檢測分離株的耐藥性 采用E-test 法分別檢測分離株對4 種抗菌藥物的耐藥性，將生長良好的細菌收集在無菌0.9%氯化鈉溶液中，吹打均勻；用麥氏比濁管調整濃度為2.0 麥氏比濁度（相當于菌液濃度2.0×108CFU/mL）；吸取100 μL 菌液至培養基上，用接種環涂布均勻并完全晾干；將抗菌藥物E-test 試紙條輕放至平板表面，在三氣培養箱中培養3 d 后觀察細菌生長情況，抑菌環與試紙條相交處的讀數即為該抗菌藥物對菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。藥敏實驗均以標準菌株ATCC 43504 作為質控菌株。按照美國臨床實驗室標準委員會的耐藥標準篩選耐藥/敏感菌：MIC≥1 μg/mL 為阿莫西林（amoxicillin，AMX）耐藥，MIC＞2 μg/mL 為LEV 耐藥，MIC≥2 μg/mL 為CLR 耐藥，MIC≥8 μg/mL 為MTZ耐藥。從中篩選出雙重耐藥（double-drμg resistant，DR）株和MDR 株，并計算各抗菌藥物的耐藥率、分離株中的DR 率、MDR 率。

1.3.2 DR 株體外誘導耐藥 采用抗菌藥物濃度遞增法對DR 株進行體外誘導培養，以1/2 MIC 作為初始誘導的藥物濃度，將DR 株依次接種在抗菌藥物濃度呈兩倍遞增的瓊脂平板上培養，重復操作直到DR 株停止生長或抗菌藥物終濃度高于最低耐藥濃度后停止誘導。將得到的耐藥株在無抗菌藥物平板上培養3 代后，用E-test 法測定其MIC 值，若達到耐藥標準為體外誘導MDR 株成功。

1.3.3 測定黃連素對MDR 株的MIC 值 采用倍比稀釋法制備黃連素濃度范圍為4～256 μg/mL 的倍比稀釋平板，將MDR 菌株制成2.0 比濁度的菌液，用27 孔細菌多點接種儀將菌液分別接種于黃連素瓊脂平板上，同時以ATCC 43504 作為質控標準菌，以不含黃連素的培養基作為空白對照，微需氧培養3 d 后觀察細菌生長情況，記錄黃連素對菌株的MIC 值。

1.3.4 測定黃連素對MDR 株耐藥性的影響 從分離MDR 株和誘導MDR 株中選取27 株高水平耐藥株，以含1/2 MIC 黃連素的液體培養基（含10%的FBS）培養MDR 菌株，先將MDR 菌株在液體培養基中復蘇后，對照組正常傳代，實驗組另外加入終濃度為1/2 MIC 的黃連素原液，對照組加入相同體積的雙蒸水，放入三氣培養箱（37 ℃、5%O2、10%CO2條件下）中培養，同時以150 r/min（離心半徑0.125 mm）的速度搖菌，每36 h傳代1 次。分別傳至第1 代和第5 代時，通過E-test 法測定其耐藥抗菌藥物的MIC 值，以黃連素作用后MIC值較對照組下降≥4 倍或變為敏感株為陽性標準。

1.4 統計學處理 采用SPSS 21.0 統計軟件。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床分離株的耐藥性 從128 株分離株中篩選出敏感株25 株、單一耐藥株61 株、DR 株30 株、MDR 株12 株，AMX、LEV、CLR、MTZ 的耐藥率分別為4.7%、26.6%、32.0%、64.8%，分離株中的總耐藥率、DR 率、MDR 率分別為80.5%、23.4%、9.4%。

2.2 MDR 株體外誘導結果 DR 株通過體外誘導耐藥共成功誘導出24 株MDR 株，AMX 誘導失敗，均為LEV、CLR、MTZ 誘導耐藥菌株，見表1。

表1 誘導耐藥株誘導前后的MIC 值變化對照表（μg/mL）

2.3 MDR 株對黃連素的耐藥性 黃連素對標準株ATCC 43504 的MIC 值為32 μg/mL，對MDR 株的MIC 值為8～128 μg/mL 水平，黃連素對MDR 株的MIC 值主要分布在32 μg/mL。

2.4 黃連素對MDR 株耐藥性的影響 27 株高水平耐藥株經黃連素處理后，共有17 株的MIC 值有陽性變化，其中包括CLR 陽性株9 株、LEV 陽性株11 株、MTZ陽性株5 株，見表2～4。比較3 種抗菌藥物陽性株的MIC 值下降幅度，MTZ 組下降幅度最大，CLR 組居中，LEV 組最低，3 組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；兩兩比較除CLR 組與MTZ 組比較差異無統計學意義（P＞0.05）外，另外兩組間比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表5。

表2 MDR 株經黃連素作用前后克拉霉素的MIC 值變化（μg/mL）

表3 MDR 株經黃連素作用前后左氧氟沙星的MIC 值變化（μg/mL）

表4 MDR 株經黃連素作用前后甲硝唑的MIC 值變化（μg/mL）

表5 3 組抗菌藥物陽性株的MIC 值下降倍數比較情況

3 討論

隨著臨床抗Hp 治療逐漸受到重視，抗菌藥物的不規范使用導致其耐藥率逐年升高。2014 至2015 年的一項Hp 耐藥率調查數據顯示：上海地區AMX、CLR、MTZ 和LEV 的耐藥率分別為0、19.8%、57.0% 和29.1%，Hp 的耐藥率、DR 率、MDR 率分別為68.6%、23.3%、7.0%[11]。本實驗的結果與之相比整體呈明顯上升趨勢，抗菌藥物耐藥形勢依舊嚴峻。具體來看：（1）AMX 的耐藥率雖有所增長，但處于較低水平，仍可作為抗Hp 方案的首選藥物；（2）Hp 的MDR 率有所升高，對于多次根除失敗的患者需考慮到MDR 的可能，應根據藥敏試驗選擇敏感抗菌藥物以提高療效[12]。

鑒于從臨床分離株中篩選的MDR 株數量有限，本研究對篩選出的DR 株進行了體外誘導耐藥。在誘導過程中發現：MTZ 誘導菌株的MIC 值均達到256 μg/mL以上，87.5% CLR 誘導菌株的MIC 值達到256 μg/mL 以上，66.7% LEV 誘導菌株的MIC 值達到32 μg/mL 以上，可見MTZ 誘導株的耐藥水平最高，CLR 次之，LEV 最低。另一方面，AMX 誘導耐藥成功率較低，誘導周期長，耐藥程度不高，這與以往的研究報道相吻合[13]。與AMX 相比，其他3 種抗菌藥物更易誘導成功。這提示臨床上對于抗Hp 治療失敗的患者，反復使用LEV、MTZ 和CLR 易發生繼發性耐藥，而AMX 仍可重復使用[14]。抗菌藥物的體外誘導耐藥成功率可用來預測人群中抗菌藥物的耐藥趨勢，為臨床抗菌藥物的選擇提供參考依據[15-16]。

黃連素又名小檗堿，是從黃連等小檗屬植物中提取的一種季銨類異喹啉生物堿，是黃連有效成分中主要的抑菌單體，歷來廣泛用于治療急性胃腸炎、細菌性痢疾等感染性消化道疾病，近年來常與三聯方案用于抗Hp 治療。一項關于“含黃連素方案”抗Hp 感染療效的Meta 分析報道，含黃連素方案的Hp 根除率和潰瘍愈合率明顯提高[17]。黃連素不僅臨床應用安全有效，而且體外抑菌實驗證明其抑菌作用很強。陳霞等[18]報道黃連素的MIC 值范圍為4～32 μg/mL，而本實驗得出的結果為8～128 μg/mL。兩者存在差異可能是因為陳霞的實驗株是隨機分離株，而本實驗所用菌株為MDR 株，且黃連素的MIC 值隨著對其他抗菌藥物的耐藥性的增強而升高，導致本研究黃連素的MIC 值偏高。吳明慧等[19]測定黃連素對6 株MDR 株的MIC 值均為12.5 mg/mL，這可能與MDR 株的來源有關：不同地區的環境、抗菌藥物使用情況不同，都會對Hp 菌株的耐藥性產生很大影響。

關于黃連素對MDR 株耐藥性的影響，劉三俠[20]報道黃連素能增強大腸桿菌MDR 株對環丙沙星的敏感性，其MIC 值降低了64 倍。本實驗發現所有MDR 株與黃連素共同培養1 代后耐藥性均無陽性變化，而培養5 代后MIC 值明顯下降，部分菌株直接變為敏感株，這表明黃連素對部分MDR 株的耐藥性具有逆轉作用，且與作用時間密切相關。這一結論也在相關研究中得到了驗證[21-22]。另一方面，黃連素的增敏作用與抗菌藥物種類有關。在3 種抗菌藥物中，MTZ 組的MIC值下降幅度最大，LEV 組最小，可見黃連素對MTZ 的耐藥逆轉作用最強，對LEV 的逆轉作用最弱。

綜上所述，黃連素能抑制MDR 株對多種常用抗菌藥物的耐藥性，且逆轉作用較強，加之其本身具有抗菌活性，故黃連素在臨床上可與其他抗菌藥物聯合用于抗Hp 治療，具有良好的應用前景。黃連素雖然能逆轉部分MDR 菌株的耐藥性，但其機制尚不明確。有研究報道Hp 對MTZ 等抗菌藥物的多重耐藥與外排泵系統密切相關[23]，黃連素可通過抑制外排泵基因的表達逆轉大腸桿菌MDR 菌株的耐藥性[20]。而黃連素是否通過調控外排泵基因的表達來逆轉Hp MDR 菌株的耐藥性，可能成為未來的研究熱點。