五味苦參腸溶膠囊對潰瘍性結腸炎大鼠的療效及作用機制研究

熊加彬 李珍 吳俊俊 李春霞 王宇芳 李華銘

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病的一種，是以結直腸黏膜連續性、彌漫性炎癥改變為特點的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，病情長期反復發作，嚴重影響患者的生活質量[1]。臨床上，輕度UC 主要以氨基水楊酸類藥物治療，中度及重度UC 以激素、免疫抑制劑及生物制劑等對癥治療為主，且需長期使用藥物，不良反應較大，患者經濟負擔重。因此，進一步探究UC 發病機制，發掘更好的治療方案有重要的臨床意義。近年的臨床及實驗室研究證實很多中藥具有很好的抗炎作用，中醫認為UC 歸于“泄瀉”“痢疾”等范疇[2]，中藥提取物具有多靶點、多層面作用的優點，從整體上分期辯證治療是中醫藥治療UC的巨大優勢。目前臨床使用五味苦參腸溶膠囊治療UC 已經取得較好效果，但其治療UC 的作用機制尚不明確。基于此，本研究分析五味苦參腸溶膠囊對UC 大鼠血清和組織IL-6、IL-10、黏液蛋白2（mucin2，MUC2）、髓過氧化酶（myelopexoxidase，MPO）水平的影響，探討該方法治療UC的可能作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF 級純種Wistar 大鼠40 只[（200±20）g]，雌雄各半，由浙江中醫藥大學動物中心提供，實驗飼養室許可證號：SYXK（浙）2021-0003。飼養條件：溫度（20～26）℃，濕度50%～60%，每12 h 明暗交替，換風15～20 次/h。本實驗經浙江鷹旸醫藥研發中心實驗動物倫理委員會審查通過（批準文號：ZJEY-20220124-04）。

1.2 主要試劑和儀器 五味苦參腸溶膠囊（北京中惠藥業有限公司，藥物組成：苦參、地榆、青黛、白及、生甘草，含生藥0.96 g/粒，批號：Z20150002），美沙拉嗪緩釋顆粒劑(葵花藥業股份有限公司，批號：H19980148），3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）試劑（美倫生物科技有限公司，批號：J0627C），山羊抗兔IgG 二抗（上海一基生物有限公司，批號：GR2545642-1），MUC2（美國Affinity 抗體公司，批號751C1445），EZ-10Total RNA Mini-Preps Kit 總RNA 小量提取試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司，批號：I829KA6099），SYBR Green qPCR 試劑盒（翌圣生物科技上海股份有限公司，批號：H0108041），逆轉錄試劑盒（江蘇康為世紀生物科技股份有限公司，批號：36320），羅氏Light-Cycler 96 實時熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏制藥公司，型號：LightCycler?96），MPO 測試盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號：20220914），IL-6 ELISA 試劑盒、IL-10 ELISA 試劑盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批號：Sep 2022）。

1.3 動物分組與造模 Wistar 大鼠適應性喂養7 d，確定大鼠健康后，采用隨機數字表法分為4 組：空白組、模型組、美沙拉嗪組、五味苦參腸溶膠囊組，每組10只。除空白組大鼠給予正常飲食外，其余3 組大鼠給予3%DSS 自由飲用7 d，次日觀察大鼠排泄物，大鼠拉稀或排出血便則表明造模成功。

1.4 干預方法 確定大鼠造模成功后，各組大鼠予常規飼料和飲水，保證大鼠生活環境通風及清潔。造模后第4 天，五味苦參腸溶膠囊組大鼠予以配制五味苦參腸溶膠囊藥物顆粒懸濁液2 mL（以成人劑量換算為大鼠劑量432 mg/kg 體質量）灌胃，美沙拉嗪組大鼠以配制的美沙拉嗪懸濁液2 mL（以成人劑量換算為大鼠劑量200 mg/kg 體質量）灌胃，空白組、模型組予0.9%氯化鈉溶液2 mL 灌胃，1 次/d，連續2 周。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 一般狀態及疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分 每日上午10：00 觀察各組大鼠精神、活動、皮毛、飲食、飲水情況，并記錄大鼠體重、糞便性狀及便血情況，稱體質量并記錄，進行DAI 評分。DAI評分=體質量下降評分+大便性狀評分+便血評分，各評分標準見表1。

表1 DAI 評分標準

1.5.2 結腸黏膜大體形態損傷指數（colon mucosa damage index，CMDI）評分 大鼠連續灌胃2 周后禁食1 d，二氧化碳吸入法安樂死，分離并切取結腸，沿腸系膜縱行剪開，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，觀察結腸黏膜大體損傷情況和評分，取2 塊病變結腸組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，取中段長約0.5 cm 的結腸組織，置入4%多聚甲醛溶液中固定，肉眼觀察黏膜損傷情況，CMDI 評分標準見表2。

表2 CMDI 評分標準

1.5.3 血清IL-6、IL-10 水平及結腸組織IL-6、IL-10 mRNA 表達水平檢測 大鼠安樂死后立即從腹主動脈取血，采用ELISA 法檢測各組大鼠血清IL-6、IL-10 水平，按試劑盒說明書操作。取結腸組織，采用qRTPCR 法檢測結腸組織IL-6、IL-10 mRNA 表達水平。qRT-PCR 引物見表3，按試劑盒說明書操作。

表3 qRT-PCR 引物

1.5.4 結腸組織MUC2 表達情況檢測 將固定后的結腸組織石蠟包埋、切片，采用免疫組化染色法，顯微鏡下觀察結腸組織MUC2 表達情況。采用K-Viewer 病理分析軟件及Image-Pro Plus 6.0 管理系統采集和處理圖像，進行半定量分析；用計算機IPP 6.0 系統測量出每個樣本累積光密度（IOD 值）和Area 值（200 倍視野下樣品面積），計算IOD/Area 比值作為相對半定量分析指標（AOD 值）。

1.5.5 結腸組織MPO 活性檢測 采用髓過氧化物酶比色法，稱取各組大鼠結腸組織約100 mg，按重量體積比為1∶19 加勻漿介質制備成5%的組織勻漿，60 ℃水浴10 min，取出后立即置于460 nm 處，1 cm 光徑，雙蒸水調零，紫外可見分光光度計測定各管吸光度值，檢測各組織MPO 活性。

1.6 統計學處理 采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組大鼠給藥干預期間一般狀態及DAI 評分比較 在給藥干預期間，4 組大鼠的毛發狀態、飲食情況、活動情況、精神狀態均正常，4組大鼠體質量比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖1；給藥干預第14 天，與模型組比較，美沙拉嗪組與五味苦參腸溶膠囊組大鼠DAI 評分均明顯降低（均P＜0.05），見圖2。

圖1 4 組大鼠給藥干預期間體質量比較

圖2 4 組大鼠給藥干預期間DAI 評分情況比較

2.2 4 組大鼠結腸黏膜組織損傷情況比較 模型組大鼠結腸黏膜明顯充血、水腫，五味苦參腸溶膠囊組、美沙拉嗪組大鼠結腸黏膜充血、水腫均明顯減輕，見圖3（插頁）。4 組大鼠CMDI 評分分別為0、1.50±0.21、0.70±0.17、0.50±0.13 分，4 組比較差異有統計學意義（F=12.622，P＜0.001）。與空白組相比，模型組大鼠CMDI 評分升高（P＜0.05）;與模型組相比，美沙拉嗪組和五味苦參腸溶膠囊組大鼠CMDI 評分均降低（均P＜0.05）。

圖3 4 組大鼠結腸黏膜形態

2.3 4 組大鼠血清IL-6、IL-10 水平及結腸組織IL-6、IL-10 mRNA 表達水平比較 4 組大鼠血清IL-6、IL-10 水平及結腸組織IL-6、IL-10 mRNA 表達水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與空白組比較，模型組大鼠血清IL-6 水平與結腸組織IL-6 mRNA 表達水平均升高（均P＜0.05），血清IL-10 水平與結腸組織IL-6 mRNA 表達水平均降低（均P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪組和五味苦參腸溶膠囊組大鼠血清IL-6 水平與結腸組織IL-6 mRNA 表達水平均降低（均P＜0.05），血清IL-10 水平與結腸組織IL-6 mRNA 表達水平均升高（均P＜0.05）。見表4。

表4 4 組大鼠血清IL-6、IL-10 水平及結腸組織IL-6、IL-10 mRNA 表達水平比較

2.4 4 組大鼠結腸組織MUC2 表達情況比較 4 組大鼠結腸組織MUC2 表達的AOD 值分別為0.50±0.04、0.26±0.03、0.40±0.05、0.46±0.03，4 組比較差異有統計學意義（F=22.211，P＜0.001）。與空白組比較，模型組大鼠結腸組織MUC2 表達下調（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪組和五味苦參腸溶膠囊組大鼠結腸組織MUC2 表達均上調（均P＜0.05）。見圖4（插頁）。

圖4 4 組大鼠結腸組織MUC2 表達情況鏡下所見

2.5 4 組大鼠結腸組織MPO 活性比較 4 組大鼠結腸組織MPO 活性分別為0（0，0）、1（1，2）、1（1，2）、0.5（0，1），4 組比較差異有統計學意義（F=40.361，P＜0.001）。與空白組比較，模型組大鼠結腸組織MPO 活性升高（P＜0.05）；與模型組比較，美沙拉嗪組和五味苦參腸溶膠囊組大鼠結腸組織MPO 活性均降低（均P＜0.05）。

3 討論

UC 病因與發病機制較為復雜，多數觀點認為是由于遺傳-環境等因素共同作用引起黏膜屏障缺失、免疫反應失調，從而維持和促進炎癥反應[3]。腸道黏膜屏障破壞在UC 發展中起決定性作用，是UC 患者預后的敏感指標[4-5]。黏液層隔離腸黏膜細胞與腸腔，保護腸黏膜細胞免受細菌及其代謝產物、食物抗原等接觸和刺激，由多種核心蛋白組成，其中最為重要是杯狀細胞分泌的MUC2。該蛋白缺失會增加腸黏膜細胞通透性，腸腔內細菌和抗原等進入誘導級聯免疫反應，進一步增加腸道屏障損傷[6]。本實驗研究發現UC 大鼠結腸組織MUC2 表達下調。這與黃強等[7]研究結果相符，但機制尚不明確。

周鈺艷[8]研究腸黏膜膠質細胞對UC 患者杯狀細胞合成分泌MUC2 的影響，發現活動期UC 的結腸黏膜MUC2 的減少與黏膜膠質纖維酸性蛋白表達增加呈正相關，黏膜膠質纖維酸性蛋白表達增加促進腸黏膜膠質細胞膠質網絡形成，通過Toll 樣受體4 通路影響MUC2 蛋白表達。本研究發現，美沙拉嗪組和五味苦參腸溶膠囊組大鼠結腸組織MUC2 表達上調，其作用機制可在今后的科研工作中進一步探討。

結腸黏膜及黏膜下層炎癥是UC 患者的主要病理特點，炎性標志物檢測有助于評估腸道炎癥程度，從而指導診斷、治療及效果評估[9]。細胞因子是炎癥標志物之一，是重要炎癥介質和免疫調節因子，IL 是參與免疫系統調節的細胞因子，分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子，IL-10 是多細胞因子，主要通過下調組織相容性復合物-Ⅱ類分子及刺激分子CD80 和CD86 表達來阻礙抗原呈遞，同時能拮抗促炎因子分泌，抑制免疫反應[10]。IL-6 屬于促炎細胞因子，炎癥反應關鍵調節劑，主要通過與靶細胞表面IL-6 受體結合形成復合物，調控炎癥因子表達[11]。劉竺華等[12]與劉景鴻等[13]分別研究斂瘡生肌灌腸療法、白黎蘆醇對UC 大鼠炎癥反應的影響，結果發現通過調控TLR4/NF-kB 通路升高血清IL-10 水平同時降低IL-6 水平可減輕UC 大鼠腸道炎癥反應。本研究結果顯示，五味苦參腸溶膠囊組與模型組相比，血清IL-6 水平及結腸組織IL-6 mRNA 表達水平降低，同時血清IL-10 水平及結腸組織IL-10 mRNA 表達水平升高。這表明五味苦參腸溶膠囊降低UC 大鼠結腸黏膜炎性因子的表達，抑制炎癥瀑布樣反應，促進黏膜修復。

既往研究發現，UC 患者結腸黏膜病理組織有大量中性粒細胞滲入，且與隱窩膿腫形成相關，其中MPO由中性粒細胞分泌，其活性反映中性粒細胞浸潤的程度，間接反應腸道炎癥，中性粒細胞富集主要通過Janus 酪氨酸蛋白激酶/信號轉導及轉錄激活因子通路，并且可促進UC 發展為結腸癌[14]。馮云等[15]研究發現UC 患者病情嚴重程度與MPO 表達呈正相關。本研究結果顯示，與模型組比較，五味苦參腸溶膠囊組結腸組織中MPO 活性顯著降低，此與Zhao 等[16]研究結果相符。上述結果說明了五味苦參腸溶膠囊能夠明顯減少UC 大鼠結腸黏膜炎癥細胞浸潤，可能具有抗感染作用。

現代中醫認為濕熱是UC 疾病活動及反復發作的重要病理因素，清腸化濕是治療基礎[17]。中醫基于“整體觀念”和“辨證論治”的個體化治療原則在治療UC方面發揮了重要作用。此外，中醫藥治療UC 有療效顯著、復發率低、不良反應少等優點，包括中藥方劑、單味中藥提取物等，如大黃素、姜黃素、忍冬素、黃連素等。五味苦參腸溶膠囊為中藥復合制劑，由苦參、地榆、青黛、白及、甘草組方，以苦參為君藥，可清熱燥濕、止血止痢。Yao 等[18]研究發現苦參堿有抗炎和調節腸道菌群的作用，可改善3% DSS 誘導的結腸炎；地榆入大腸、肝經，可涼血止血、解毒斂瘡。朱陽青[19]研究表明地榆能降低DAI 評分，同時具有收斂、殺菌、抗炎等作用，青黛與地榆同用，可增強其清熱解毒、涼血止血之效，乃臣藥。Xie 等[20]研究發現青黛能改善DSS誘導的UC 大鼠的體重減輕，還可通過調節腸道微生態改善結腸炎，白及有收斂止血、消腫生機之效，佐助君臣藥。Gong 等[21]研究白及可降低炎癥反應，生甘草可調和諸藥，清熱解毒，并緩急止痛。Kong 等[22]研究甘草可能是通過激活核因子E2 相關因子2/PTEN 誘導假定激酶1 途徑促進線粒體自噬降低UC 小鼠的炎癥因子和氧化應激水平。刁凌云等[23]研究發現單用五味苦參腸溶膠囊可改善UC 患者臨床癥狀。上述多項臨床及實驗研究表明五味苦參腸溶膠囊治療UC 有較好療效，但主要集中在對受體表達、炎癥因子水平等機制方面的研究。

綜上所述，本研究發現五味苦參腸溶膠囊能夠明顯改善UC 大鼠DAI 及CDMI 評分，降低促炎因子IL-6水平，升高抗炎因子IL-10 水平，上調UC 大鼠MUC2 的表達，同時降低MPO 活性，促進UC 大鼠腸道黏膜屏障修復，快速緩解UC 大鼠炎癥反應。這為五味苦參腸溶膠囊臨床治療UC 提供理論參考，并為進一步研究五味苦參腸溶膠囊治療UC的作用機制提供實驗基礎。