臍帶血造血干細胞體外生成紅細胞過程中高效脫核體系的研究

陳晨 占啟剛 盛琦 張晶晶 應燕玲 章偉 朱發明 何吉

臍帶血、成人骨髓、外周血來源的造血干（祖）細胞及胚胎干細胞、誘導多能干細胞等可在體外大量誘導生成紅細胞[1]。然而在體外培養生成的紅細胞中，能實現脫核的紅細胞只占極少數，多數紅系細胞停留在晚幼紅細胞階段，不能完成脫核步驟。已證實只有脫核的成熟紅細胞才能發揮正常的生理功能，而有核紅細胞的攜氧功能明顯較低。因此，脫核是體外生成成熟紅細胞能否成功應用的關鍵步驟之一；但在體外培養過程中脫核效率較低[2-3]。為了提高造血干細胞生成成熟紅細胞的能力，根據實驗室前期研究基礎，本實驗選擇可能促進紅系細胞脫核的磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol trihydroxykinase，PI3K）、細胞松弛素B 和組蛋白脫乙酰化酶2（histone deacetylase 2，HDAC2）作為脫核劑，探討這3 種脫核劑促紅系脫核過程中的作用，以建立體外生成紅細胞高效脫核體系，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 CD34+細胞免疫磁珠分選試劑、CD34+細胞分選緩沖液Buffer（德國美天旎公司）；1.077 Ficoll淋巴細胞分離液（美國GE 公司）；pH 7.2 PBS（美國Gibco 公司）；無血清培養基（Stem SpanTMSFEM，加拿大Stem Cell 公司）；促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、干細胞生長因子（stem cell factor，SCF）、IL-3（美國PeproTech Inc 公司）；CD235-FITC 抗體（美國Biolegend 公司）、SYTO-64 核酸染料（美國Invitrogen 公司）；人2,3-二磷酸甘油酸（2,3-Diphosphoglycerate，2,3-DPG）酶聯免疫分析試劑盒（美國Sigma 公司）；ATP 測定試劑盒（美國Promega 公司）；細胞松弛素B（英國abcam 公司）、PI3K（英國Millipore 公司）、HDAC2（美國Cayman Chemical 公司）。

1.2 方法

1.2.1 臍帶血采集 臍帶血來自浙江省臍帶血造血干細胞庫自愿無償捐獻者，均簽訂知情同意書。正常健康產婦足月順產胎兒娩出后，立即斷臍，消毒行靜脈穿刺，用臍帶血收集袋收集臍帶血。本研究經浙江省血液中心醫學倫理委員會審查通過（批準文號：省血液中心倫審2023 年研第002 號）。

1.2.2 臍帶血單個核細胞分離 用0.9%氯化鈉溶液1∶1 稀釋臍帶血，加到比重為1.077 g/mL 的淋巴細胞分離液上，1 500 r/min（423 g）離心35 min，收集中間的單個核細胞層。加入PBS 溶液重懸，2 000 r/min（751 g）離心10 min，去上清液，重復上述操作。最后用CD34+細胞分選緩沖液Buffer 300 μL 重懸細胞。

1.2.3 CD34+細胞分選富集 采用CD34+細胞免疫磁珠分選試劑（包含FcR Blocking Reagent、microbeads），嚴格按試劑盒說明書操作。加100 μL FcR Blocking Reagent 于上述細胞懸液中，混勻，加100 μL microbeads，混勻，2～8 ℃冰箱中孵育30 min，加10 mL Buffer，1 000 r/min（300 g）離心10 min，去上清液，加500 μL Buffer 懸浮細胞。將分選柱子放入磁鐵中，加500 μL Buffer 于柱中濕潤柱子，將細胞懸液加到柱中過柱，加500 μL Buffer 洗3 次。將柱子移出磁鐵，放入收集管中，加1 000 μL Buffer 于柱中，加壓使細胞洗下來，重復磁珠分選步驟。

1.2.4 臍帶血造血干細胞體外生成紅細胞體系的構建 將富集的CD34+細胞用無血清培養基混勻后，以104個細胞/mL 濃度接種至無血清培養基中，培養體系為10 mL。置37 ℃、5% CO2濕度培養箱中培養21 d，第4、7、11、15、18 天半量換液。第7 天將細胞濃度調整至105個細胞/mL，第11 天細胞濃度調整至5×105～1×106個細胞/mL，第15 天將細胞濃度調整至5×106～10×106個細胞/mL。添加細胞因子如下：第0、4 天：EPO（33.3 ng/mL）+SCF（100 ng/mL）+IL-3（5 ng/mL）。第7 天：EPO（33.3 ng/mL）+SCF（100 ng/mL）。第11、15、18 天：僅添加EPO（33.3 ng/mL）。

1.2.5 臍帶血造血干細胞體外生成紅細胞體系3 種脫核劑濃度和添加時間的優化選擇 PI3K、細胞松弛素B、HDAC2 3 種脫核劑分別設置4 個濃度和添加時間。利用4 因素4 水平的正交設計進行實驗分組。在培養期間加入脫核劑時轉為6 孔板培養，培養體系為2 mL，細胞數為5.5×105個/孔。設置不加脫核劑孔作為對照組。4 因素為：脫核劑PI3K、HDAC2、松弛素B 和加入脫核劑時間。每個因素有4 個水平：PI3K 濃度為0、20、50、100 ng/mL；HDAC2 濃度為0、60、150、300 ng/mL；松弛素B 濃度為0、25、50、75 ng/μL；加入脫核劑的時間為第7、11、15、18 天。見表1。采用L16（44）正交實驗設計表，分成16 組，見表2。以紅細胞脫核率為評價指標，考察各個因素對紅細胞脫核的影響。

表1 實驗因素和水平

表2 正交實驗設計表

1.2.6 優化條件的驗證實驗 根據正交實驗得到的優化條件作為優選組，以不加脫核劑作為對照組，用1.2.4 構建的體系，加入脫核劑，進行臍帶血造血干細胞體外生成紅細胞培養，評估紅細胞脫核的效果。

1.2.7 流式細胞術檢測 取50 μL 細胞懸液加入流式管中，加入流式抗體CD235-FITC 2 μL，每106個細胞加入稀釋的SYTO-64 核酸染液1 ml（1 μL SYTO-64 核酸原染料加1 mL 0.9%氯化鈉稀釋），輕微振蕩混勻，避光孵育30 min，洗去未結合的熒光抗體后，使用流式細胞儀上機檢測和分析。脫核率（%）=SYTO-64-細胞比例/CD235+細胞比例×100%。

1.2.8 細胞染色觀察 取10 μL 培養細胞懸液到載玻片上涂開，形成直徑1 cm 左右的涂片，自然晾干，瑞氏吉姆薩染色，按試劑盒說明書操作。

1.2.9 細胞電鏡檢測 對培養的紅細胞通過固定、洗滌、染色、脫水、干燥后將樣本轉移到S-3000N 掃描電子顯微鏡（日本日立公司）載樣臺上，噴鉑金，電鏡檢測。

1.2.10 紅細胞2,3-DPG 含量檢測 采用ELISA 法檢測紅細胞2,3-DPG，嚴格按試劑盒說明書操作。取1 mL PBS稀釋后的細胞懸液，置-20 ℃冰箱冷凍20 min。取出融化后2 000 r/min 離心20 min，取上清液作為樣本。配置標準品。在酶標包被板上分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔。加50 μL 樣品于酶標板孔底部，37 ℃溫育30 min 后，洗板，加酶溫育30 min，洗板，顯色，加終止液。根據標準品OD 值作出回歸曲線，并得出曲線方程，將待測樣品的OD 值代入方程，得出相應濃度，再乘以稀釋倍數，即得到待測樣品細胞內的2,3-DPG 含量。

1.2.11 紅細胞ATP 含量檢測 采用化學發光法檢測，嚴格按試劑盒說明書操作。用PBS 稀釋細胞懸液成1×107/mL。配制標準品，分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔。加100 μL 樣品，每孔做復孔。每孔加入100 μL celltiter-glo 試劑，室溫孵育10 min 穩定熒光信號值。發光檢測儀記錄發光值。根據標準品發光值作出回歸曲線，并得出曲線方程，將待測樣品的發光值代入方程，得出待測樣品細胞內的ATP 含量。

1.2.12 檢測紅細胞計數 采用Sysmex xs-900i 血細胞計數儀（日本希森美康公司）測RBC。

1.3 統計學處理 采用SPSS 22.0 統計軟件設計正交方案。采用GraphPad Prism 8.0 軟件處理驗證數據。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臍帶血造血干細胞體外生成紅細胞體系脫核劑濃度和加入時間選擇 根據正交設計實驗計算出的R值可知，各因素對脫核率的影響大小依次為松弛素B、加脫核劑時間、PI3K、HDAC2，即松弛素B 對脫核率影響最大。通過K值判斷，優選條件為第15 天加脫核劑、PI3K 濃度100 ng/mL、HDAC2 濃度150 ng/mL、松弛素B濃度75 ng/μL，以此優選條件作為優選組。見表3。

表3 體外生成紅細胞體系脫核劑濃度和加入時間

2.2 優選條件的驗證實驗結果 優選組與對照組CD235+細胞比例比較差異無統計學意義（P＞0.05）。優選組SYTO-64-細胞數及脫核率明顯高于對照組（均P＜0.05）。優先組與對照組紅細胞內ATP、2,3-DPG比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。按照優選條件培養至第21 天的結果見表4。

表4 優化條件的驗證實驗結果

2.3 RBC 和形態分析結果 初始104個CD34+細胞經本實驗體系培養后，第21 天RBC 平均可達2×1010/L。培養至第18 天出現成熟無核紅細胞，見圖1（插頁）。

圖1 培養至第18 天時細胞形態

2.4 紅細胞電鏡觀察結果 培養第21 天的細胞通過電鏡觀察可見典型的雙凹圓盤狀，見圖2（插頁）。

圖2 培養第21 天的紅細胞電鏡照片

3 討論

對于嚴重貧血或需要外科手術輸血的患者，紅細胞輸注是一種成熟且不可替代的治療方法。然而，全球范圍內異體血液供應存在嚴重緊缺狀態，而且異體輸血時涉及血液傳播疾病以及輸血后并發癥等問題，因此尋找紅細胞的替代來源在血液領域十分迫切和必要[4]。目前，紅細胞替代來源的研究主要集中在全氟化碳、Hb 氧載體和干細胞誘導紅細胞等方面，其中干細胞誘導生成紅細胞是指通過使用胚胎干細胞、誘導多能干細胞或造血干細胞在體外經過一系列誘導分化產生紅細胞的過程[5-6]。體外生成紅細胞是模擬體內紅細胞形成的過程，需要經過脫核步驟才能形成成熟的無核紅細胞，脫核過程則是紅細胞成熟終末階段發生的關鍵事件。在體外培養生成紅細胞體系中，脫核效率低下是一個較常見的問題[7-9]，目前在誘導干細胞紅系分化的體系中，只有在基質細胞的輔助下誘導造血干（祖）細胞才能實現較為高效的成熟和脫核效率，但基質細胞會影響其后續的應用；而無基質細胞體系或是以胚胎干細胞、誘導多能干細胞為起始細胞的誘導體系中，紅細胞成熟和脫核效率仍然有待提高。研究表明，在體外條件下通過誘導人胚胎干細胞可以獲得脫核紅細胞，但是其脫核率在60%左右[10-11]；多能干細胞在體外誘導條件下可以獲得晚幼紅細胞，但是其脫核率僅有4%～10%[12]。因此如何提高體外培養體系紅細胞脫核率就顯得尤為重要，值得繼續深入研究。

早期研究觀察到細胞松弛素B 能誘發體外培養的小鼠L 細胞發生脫核作用；隨后的研究發現在體外培養的條件下，細胞松弛素B 對人紅白血病K562 細胞也有誘導脫核的作用[13-14]。除此之外，研究發現在紅細胞脫核的過程中，還有眾多的蛋白質及因子參與其中，其中組蛋白去乙酰化酶2 對紅細胞的脫核有重要的調控作用[15-17]。使用組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古霉素A 和丙戊酸作用于即將脫核的細胞，能明顯地抑制染色體的凝集、肌動蛋白收縮環的形成以及細胞的脫核。Chao 等[18]研究發現當紅細胞脫核時，PI3K 的產物磷脂酰二磷酸和磷脂酰三磷酸在細胞膜的胞質側聚集，抑制PI3K 功能可阻礙細胞極化，導致細胞脫核受阻，提示紅細胞去核過程依賴于PI3K 調控的細胞極化。進一步研究發現此過程是由微管介導PI3K 信號通路的活化，引發肌動蛋白的不對稱聚集，從而導致細胞極化現象的產生，并且這種現象的產生對下一步細胞核的移位及最終細胞核的排出有重要的意義。

本實驗室前期進行了PI3K、細胞松弛素B 和HDAC2 對紅細胞脫核作用的單因素分析，結果顯示3種因子分別對紅細胞脫核均有促進作用，脫核率可達40%～60%，這提示如果3 種脫核劑共同作用或能更好地促進脫核，提高脫核率。因此，本實驗設計4 因素4水平正交實驗，3 種脫核劑不同濃度、不同加入時間共16 個組合分析脫核效果。實驗得出優化條件為第15天加脫核劑，PI3K 濃度為100 ng/mL，HDAC2 濃度為150 ng/mL，松弛素B 濃度為75 ng/μL。并根據此優化條件作為優選組進行驗證，結果顯示與對照組相比，優選組SYTO-64-細胞數及脫核率明顯高于對照組，脫核率達74.30%。而且成熟紅細胞形態和功能正常，說明3 種脫核劑存在協同作用，這為體外誘導分化紅細胞脫核提供了一種可行的方法。

綜上所述，目前有關體外生成紅細胞脫核過程的具體機制尚不完全清楚，而干細胞體外生成紅細胞過程中紅細胞脫核率較低，這已成為體外獲取功能性紅細胞的主要技術瓶頸之一。盡管本研究提升了紅細胞脫核率，但仍不能滿足臨床需求，今后將進一步研究建立體外生成紅細胞高效脫核培養體系，為臨床輸血提供一種新的來源，有利于提升血液安全。