低蛋白與酮酸飲食干預對糖尿病腎病小鼠腎臟功能的影響

吳宇 謝祥成 趙寧 楊秀

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病微血管病變的常見慢性并發癥之一，以腎小球基底膜增厚、通透性增加，系膜細胞增殖及細胞外基質增多為主要病理改變，表現為持續性白蛋白尿[1]。除了合理藥物治療積極控制血糖之外，飲食治療是糖尿病治療的重點，同時也是DN 患者治療的基礎[2]。低蛋白飲食是指在滿足機體營養的情況下，降低機體蛋白攝入量的一種膳食方式，其目的是減少體內代謝廢物，減輕腎臟代謝負荷[3]。研究顯示，低蛋白結合酮酸飲食可有效降低DN 患者24 h 尿白蛋白排泄率，抑制機體氧化應激水平，對延緩腎功能損傷起到一定作用[4-5]。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)參與腎小球硬化及腎小管間質纖維化，TGF-β1 的激活與DN 發展有關[6]。基于此，本研究探討低蛋白補充酮酸對DN 小鼠腎臟功能的改善作用和對腎組織TGF-β1 含量影響，分析完善低蛋白飲食方式延緩DN進展的作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級db/db 小鼠（2 型糖尿病腎病模型小鼠）18只、db/m 小鼠（db/db 小鼠的對照）6 只（7 周齡，均為雄性），購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司[動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0008], 飼養于浙江鷹旸醫藥研發有限公司屏障系統[許可證號：SYXK（浙）2021-0003]。系統環境為恒溫（22±2）℃、恒濕（50%～60%），通風，12 h 明暗交替光照。本研究經浙江鷹旸醫藥研發有限公司實驗動物倫理委員會審查通過（批準文號：ZJEY-20230619-01）。

1.1.2 主要試劑和儀器 正常蛋白飼料、低蛋白飼料、低蛋白-酮酸飼料均購自天津科澳協力飼料有限公司。Ⅳ型膠原（ⅣCollagen，Ⅳ-Col）、TGF-β1 抗體購自美國affinity 抗體公司（批號：82A6748、20r6523）。E100 顯微鏡購自日本尼康公司；KF-PRO-120 全景掃描儀購自寧波江豐生物信息技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與飲食干預 18 只db/db 小鼠適應性飼養1 周后尾靜脈采血測定空腹6 h 血糖，平均血糖值≥16.7 mmol/L，采用隨機數字表法分為正常蛋白飲食組、低蛋白飲食組、低蛋白-酮酸飲食組，每組各6 只，分別給予正常蛋白飲食（添加24%酪蛋白）、低蛋白飲食（添加6%酪蛋白）、低蛋白-酮酸飲食。6 只db/m 小鼠設為正常對照組，給予正常蛋白飲食。各組小鼠以對應飼養方式連續喂養12 周，結束后進行后續相應指標檢測。

1.2.2 指標檢測

1.2.2.1 基本指標檢測 自喂養開始至結束，每隔2 周測定各組小鼠體重。喂養結束后，小鼠當天禁食過夜，第2 天記錄小鼠的24 h 飲水量及排尿量。

1.2.2.2 生化指標檢測 記錄小鼠24 h 飲水量及排尿量后，立即通過眼眶靜脈叢取血。血糖儀檢測血糖；分離血清，采用全自動生化分析儀檢測血肌酐、尿素氮、TG 和TC。

1.2.2.3 腎臟體積、腎重/體重比值檢測 小鼠取血后，立即二氧化碳安樂死，稱體重。取小鼠雙側腎臟，測量腎臟橫徑以大體反映腎臟體積，并拍照記錄，稱重量，計算腎重/體重比值。保留腎臟組織用于后續檢測。

1.2.2.4 腎臟組織病理變化檢測 制備腎臟組織石蠟切片，常規脫蠟至水。HE 染色，鏡下觀察腎臟組織病理變化。同時行過碘酸雪夫染色（periodic acid-Schiff stain，PAS）：烤箱（62 ℃）烘烤切片1 h，脫蠟、水化、清洗；0.5%過碘酸水溶液孵育氧化5 min，蒸餾水徹底清洗；雪夫染色試劑孵育20 min，清洗；哈瑞蘇木素染細胞核1 ～2 min，流水清洗；乙醇脫水后透明，封片，鏡下觀察系膜基質、基底膜增生和糖原聚集情況（染色紅紫色為陽性）。

1.2.2.5 腎臟組織TGF-β1 和Ⅳ-Col 表達水平檢測采用免疫組化染色法，腎臟組織切片烘烤、脫蠟、水化，過氧化氫阻斷溶液阻斷內源性過氧化物酶，PBS 清洗。抗原修復，PBS 清洗甩干，封閉液封閉20 min。稀釋（1∶100）的TGF-β1、Ⅳ-Col 一抗抗原，4 ℃過夜孵育。隔天取出，常溫放置1 h，清洗。隨后孵育二抗30 min，清洗。顯色試劑孵育反應，根據顯色程度終止反應，清洗后，蘇木素復染細胞核，清洗，脫水。透明標本，封片，顯微鏡下觀察陽性表達情況（染色黃色至棕黃色為陽性）。用Image J 軟件定量分析免疫組化圖，通過AOD 值作統計圖。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4 組小鼠基本指標比較 與正常對照組比較，正常蛋白飲食組小鼠喂養第2、4、6、8、10、12 周的體重均增加（均P＜0.05）；24 h 飲水量和排尿量均增加（均P＜0.05）。與正常蛋白飲食組比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠第2、4、6、8、10、12 周體重均減輕（均P＜0.05）；24 h 飲水量和排尿量均減少（均P＜0.05）。見表1、表2。

表1 4 組小鼠體重比較（g）

表2 4 組小鼠24 h 飲水量和排尿量比較（mL）

2.2 4 組小鼠生化指標變化 4 組小鼠血糖、血肌酐、血尿素氮、TG、TC 水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與正常對照組比較，正常蛋白飲食組小鼠血糖、血肌酐、尿素氮、TG、TC 水平均升高（均P＜0.05）。與正常蛋白飲食組比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠血糖、血肌酐、尿素氮、TG、TC 水平均降低（均P＜0.05）。見表3。

表3 4 組小鼠生化指標改變

2.3 4 組小鼠腎臟體積、腎重/體重比值比較 與正常對照組相比，正常蛋白飲食組小鼠腎臟體積增大，且腎臟周圍出現較多脂肪，小鼠腎重/體重比值上升（P＜0.01）；與正常蛋白飲食組小鼠比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠周圍的脂肪明顯減少，腎臟體積縮小，小鼠腎重/體重比值顯著下降（均P＜0.05）。見圖1（插頁）、表4。

表4 4 組小鼠腎重/體重比值比較（mg/g）

圖1 4 組小鼠腎臟體積肉眼觀察比較

2.4 4 組小鼠腎臟組織病理變化比較 正常對照組小鼠腎臟組織形態正常，腎小球系膜無增生，組織內未見明顯炎性細胞浸潤或結締組織增生；正常蛋白飲食組小鼠腎小球形狀不規則，系膜基質增生，并出現炎性細胞浸潤。與正常蛋白飲食組小鼠比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠腎小球系膜增生有所改善。見圖2（插頁）。

圖2 4 組小鼠腎臟組織病理變化鏡下所見

2.5 4 組小鼠腎臟組織TGF-β1 和Ⅳ-Col 水平比較4 組小鼠腎臟組織TGF-β1 和Ⅳ-Col 水平比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與正常對照組比較，正常蛋白飲食組小鼠腎組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平均升高（均P＜0.05）。與正常蛋白飲食組比較，低蛋白飲食組和低蛋白-酮酸飲食組小鼠腎組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平均降低（均P＜0.05）。見圖3（插頁）、圖4。

圖4 4 組小鼠腎臟組織TGF-β1 和Ⅳ-Col 水平比較

3 討論

蛋白質攝入可促進腎小球血管擴張，促進胰高血糖素分泌，升高機體血糖水平，因此對于早期DN 患者，限制膳食中蛋白質含量可減輕腎臟負擔，并控制機體血糖水平[7]。通過既往DN 動物模型可了解到，低蛋白飲食或聯合酮酸可減輕DN 鼠腎臟肥大，減輕腎小球系膜基質積聚以及腎小球基底膜增厚等腎臟病理改變，改善血糖、血脂等生化指標[8-9]。本研究中，自發性2 型糖尿病動物模型db/db 小鼠分別用正常蛋白飼料、低蛋白飼料、低蛋白-酮酸飼料喂養12 周后，在低蛋白喂養的方式下，db/db 小鼠體重下降，飲水量、排尿量增加，血糖水平下降，血脂TG、TC 指標含量下降，腎臟體積縮小，腎周圍脂肪組織減少，其中聯合酮酸可加強對各項指標的控制，表明低蛋白或聯合酮酸可改善db/db 組小鼠基本指標以及DN 相關生化指標，減輕DN 小鼠腎臟肥大。

TGF-β1 是目前較為明確的腎臟纖維化誘導因子，通過誘導腎小管上皮細胞間質轉化和膠原合成，參與DN 進展[10-11]。張世魯等[12]研究表明，抑制DN 大鼠腎臟組織TGF-β1 表達，可改善大鼠腎臟組織纖維化程度。Ⅳ-Col 是腎小球細胞外基質的主要膠原組成成分，在DN 早期合成增加[13]。唐詩等[14]研究表明，高糖誘導可促進小鼠系膜細胞TGF-β1 基因表達，和細胞上清液Ⅳ-Col 含量。本研究染色結果顯示，正常蛋白飲食組小鼠腎小球形狀改變，基底膜增厚，組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平較正常對照組小鼠顯著升高，而低蛋白或聯合酮酸飼養可顯著降低db/db 小鼠腎組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平，減少系膜基質增生，提示低蛋白或聯合酮酸飲食可能通過降低腎臟組織TGF-β1、Ⅳ-Col 水平而減少DN 小鼠腎臟系膜基質增生。

綜上所述，低蛋白和酮酸補充的飲食方式可改善DN 小鼠生化指標，降低腎臟組織TGF-β1、Ⅳ-Col 表達水平，改善腎組織損傷形態，具有延緩DN 腎損傷的作用。