基于網絡藥理學研究浙貝母-山慈菇藥對干預甲狀腺癌的作用機制

侯鵬霄，樊茜

（山西省腫瘤醫院／中國醫學科學院腫瘤醫院山西醫院／山西醫科大學附屬腫瘤醫院，山西太原 030013）

我國甲狀腺癌的發病率呈持續上升趨勢，研究表明，我國甲狀腺癌的發病率為20.3／10萬，是目前常見的內分泌系統惡性腫瘤［1］。山西省腫瘤醫院中醫科張勇主任通過對治療甲狀腺癌的經驗處方進行總結、提煉，發現具有化痰消癰、清熱解毒功效的藥對——浙貝母、山慈菇在治療甲狀腺癌的過程中能協同增效，有效控制腫瘤的發展。浙貝母為苦寒之品，功擅清熱解毒、化痰消腫散結?，F代藥理研究證實，浙貝母含有多種生物堿、總皂苷、黃酮類及多糖類成分，有祛痰止咳、抗炎殺菌、止痛、抗腫瘤等功效，還能逆轉腫瘤耐藥［2-3］。山慈菇性寒，味甘、微辛，可清熱解毒，散結消癰止痛，臨床用于治療各種瘡癰腫毒、瘰疬痰核［4］。吳俊林［5］在甲狀腺癌細胞株培養基中添加山慈菇提取物，發現處理后的甲狀腺癌細胞的NIS mRNA表達上調，說明山慈菇可抑制甲狀腺癌細胞的增殖。中醫認為，甲狀腺癌的基本病機是氣滯、痰凝、血瘀［6］。浙貝母有開郁散結之力，山慈菇可化痰散結解毒，二者相須為用，協同增效，共奏解毒化瘀散結之功。研究表明，山慈菇、浙貝母均有抗腫瘤作用，但對二者干預甲狀腺癌的機制尚不明確［2，7］。網絡藥理學結合醫學、生物信息學、計算機科學等多學科，探索藥物對疾病靶點網絡的干預和影響，對組合藥物研究有較大的幫助［8］。本研究利用網絡藥理學的相關研究方法，以山慈菇-浙貝母藥對的核心成分為基礎，探討其治療甲狀腺癌的機制，為后續研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 山慈菇、浙貝母成分篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）中分別檢索浙貝母、山慈菇的化學成分，以口服利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18為篩選條件初步篩選出浙貝母、山慈菇活性化合物。

1.2 藥物相關靶點的收集 獲得浙貝母、山慈菇的預測靶點，并根據已發表的文獻報道補充已知的但數據庫中沒有預測到的靶點，然后通過UniProt數據庫（Universal Protein，https：／／www.uniprot.org／）檢索獲得的靶點信息，進一步規范靶點。

1.3 甲狀腺癌相關靶點篩選 在疾病靶點數據庫GeneCards（https：／／www.genecards.org／）和OMIM（https：／／omim.org／）中以“Thyroid Carcinoma”“Thyroid Cancer”為關鍵詞進行檢索，將檢索結果合并，剔除檢索到的重復數據，得到甲狀腺癌的相關靶點。

1.4 藥物-成分-靶點網絡構建 運用Cytoscape 3.7.1軟件建立浙貝母-山慈菇藥對治療甲狀腺癌的藥物-成分-靶點網絡。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建與分析 使用Cytoscape 3.7.1軟件中的Biso Genet建立“藥物成分靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡”和“甲狀腺癌靶點PPI網絡”。通過軟件中的“Mergre”選項取交集，最終得到藥物成分靶點及甲狀腺癌靶點的交集網絡。使用“Analyze network”選項分析網絡拓撲參數，分析的內容為Degree、Betweenness、Closeness和Neighborhood Connectivity（NC）。篩選關鍵靶點，并從取得的關鍵靶點中以≥這4個指標的中位數為界，篩選出藥物活性成分和甲狀腺癌關系較為密切的關鍵靶點，并對結果進行可視化呈現。

1.6 GO和KEGG功能富集分析 將上述研究中得到的核心靶點輸入Metascape數據庫（http：／／metascape.org）中進行核心靶點的基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能通路富集分析。結果以氣泡圖展示。

2 結果

2.1 浙貝母、山慈菇有效成分 以OB≥30%、DL≥0.18篩選后，浙貝母得到7個有效活性成分，山慈菇得到3個有效活性成分。經查閱文獻，浙貝母中補充貝母素甲、貝母素乙。浙貝母-山慈菇藥對共有11個有效活性成分，其中共有1個活性成分。見表1、2。

表1 浙貝母主要成分信息表

表2 山慈菇主要成分信息表

2.2 藥物相關靶點 山慈菇獲得50個靶點，浙貝母獲得68個靶點，二者合并后共獲得75個靶點。

2.3 相關靶點收集 在OMIM 數據庫中，采用“Thyroid Cancer”為關鍵詞檢索得到相關靶點612個，采用“Thyroid Carcinoma”為關鍵詞檢索得到277個相關靶點，合并后有838個相關靶點。在GeneCards數據庫中，采用“Thyroid Cancer”為關鍵詞檢索得到11 820個相關靶點，采用“Thyroid Carcinoma”為關鍵詞檢索得到10 088個相關靶點。對GeneCards數據庫獲得的靶點根據經驗選定“Relevance score”＞8.62為界線，去掉重復項，最終獲得相關靶點1 703個。將2個數據庫得到的靶點進行合并，并刪除重復項，最終得到2 357個靶點。

2.4 藥物-成分-靶點網絡模型構建 將得到的藥物活性成分、成分作用的基因靶點及甲狀腺癌的基因靶點交集輸入Cytoscape中，得到的藥物-成分-靶點圖中共有87個節點、176條邊。網絡圖中藍色節點表示藥物，紫色節點表示活性成分，黃色節點表示藥物共有的活性成分，紅色節點表示藥物成分作用的靶點。經網絡拓撲學分析顯示：藥對的4種活性成分可以和10個以上的靶點相連接，分別是β-谷固醇（Degree＝73）、豆甾醇（Degree＝32）、2-甲氧基-9，10-二氫菲-4，5-二醇（Degree＝31）、天竺葵色素（Degree＝16）（掃描題目右側二維碼查看圖1）。

2.5 基于Cytoscape的PPI網絡構建 得到與藥物活性成分具有直接或間接相互作用關系的靶點1 933個，關系網絡有34 885條連接線，得到與甲狀腺癌有直接或間接相互作用關系的靶點12 979個，關系網絡有243 144條連接線。將上述2個PPI網絡通過Cytoscape中的Intersection功能獲取交集，得到1個包含1 875個靶點、34 534條相互作用關系的網絡。在獲得的交集網絡中，計算得出Degree的中位數為21，以兩倍中位數為界篩選出Degree≥42的下級網絡，該網絡有519個靶點，共計16 618個相互作用關系。因靶點數目較多，需要進一步再次篩選該下級網絡。計算得出該網絡的Degree、Betweenness、Closeness、NC 的中位數分別為73、212.582、0.522、95.872，以Degree ≥73、Betweenness≥212.582、Closeness≥0.522、NC≥95.872為篩選條件，得到關鍵蛋白靶點96個，存在相互作用關系972條（掃描題目右側二維碼查看圖2）。

在96個關鍵靶點中，前10個與活性成分和甲狀腺癌均直接相關的靶點分別為NPM1（Degree＝210）、HSPA5（Degree＝206）、HDAC5（Degree＝169）、HNRNPA1（Degree＝161）、HUWE1（Degree＝157）、HSPA4（Degree＝153）、PRKDC（Degree＝147）、TUBB（Degree＝146）、HSPB1（Degree＝134）、PARP1（Degree＝134）。Degree值最高的2個靶點分別為NPM1和HSPA5，可以認為這2個靶點是浙貝母-山慈菇藥對治療甲狀腺癌較關鍵的核心靶點（掃描題目右側二維碼查看圖3）。

2.6 核心靶點GO 及KEGG功能富集分析 分別從細胞組分、分子功能、生物過程3個方面對核心靶點進行GO及KEGG功能富集分析，結果見圖4（掃描題目右側二維碼查看）。其中細胞組分主要與核糖核蛋白復合物、蛋白質-DNA復合物、核斑點、核染色體等有關，見圖4A（掃描題目右側二維碼查看）。分子功能主要與組蛋白脫乙酰酶結合、泛素蛋白連接酶結合、激酶結合、轉錄因子結合、蛋白質結構域特異性結合、鈣粘蛋白結合、ATP 依賴性活性、染色質結合等功能有關，見圖4B（掃描題目右側二維碼查看）。生物過程與調節細胞對壓力的反應、DNA代謝過程、蛋白質穩定性調節、細胞酰胺代謝過程的正向調節、核糖體生物發生等功能有關，見圖4C（掃描題目右側二維碼查看）。KEGG信號通路富集主要包括新型冠狀病毒感染、細胞凋亡、剪接體及缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路和細胞周期等信號通路，見圖4D（掃描題目右側二維碼查看）。

3 討論

本研究首先對數據庫進行數據挖掘，從浙貝母-山慈菇這一甲狀腺癌常用藥對中檢索出11個活性成分和75個作用靶點。結合甲狀腺癌的疾病相關靶點進一步構建藥物-成分-靶點網絡，推導出β-谷固醇、豆甾醇、2-甲氧基-9，10-二氫菲-4，5-二醇、天竺葵色素4個活性成分為浙貝母-山慈菇藥對干預甲狀腺癌的主要活性成分。

有研究表明，β-谷甾醇可以阻斷p53-MDM2的結合，進而激活p53，最終使p53轉移到細胞核，同時還可以抑制NF-κB途徑。β-谷甾醇聯合奧沙利鉑在體內有協同抑制腫瘤的作用［9］。而豆甾醇通過PI3K-Akt信號通路可抑制卵巢癌細胞活性［10］。天竺葵色素可以誘導自噬，并且引發活性氧誘導的線粒體膜電位減少，進而引發G2／M 細胞周期停滯，還可以通過濃度依賴的方式減少p-PI3K 和p-AKT 的表達［11］。關于2-甲氧基-9，10-二氫菲-4，5-二醇的研究文獻較少，但本次研究發現其能與多個靶點連接，表明其在抗腫瘤方面有潛在的活性，可以作為進一步研究的方向。

PPI網絡中篩選出NPM1和HSPA5作為核心靶點。NPM1在細胞中的亞細胞定位主要在核仁，其能自由地通過細胞核膜到達胞質，對細胞生長和體內平衡具有關鍵作用［12］。NPM1的表達水平與腫瘤分期和預后顯著相關。NPM1與翻譯起始、核糖體、核糖體結構成分和RNA轉運密切相關。NPM1的主要富集途徑相關差異基因主要與m TORC1介導的信號通路、p53缺氧通路、癌癥EGFR 信號通路、抗原激活β細胞受體BCR導致產生第二信使、有氧糖酵解和甲基化通路有關。NPM1的表達水平與β細胞和NK細胞呈負相關。NPM1的表達與1個m6A 修飾相關基因（YTHDF2）和5 個糖酵解相關基因（ENO1、HK2、LDHA、LDHB和SLC2A1）顯著相關［13］。HSPA5編碼的結合免疫球蛋白（BIP）主要存在于內質網中，負責將蛋白質轉移至內質網，參與折疊內質網中的蛋白質底物、啟動未折疊蛋白質反應（UPR）、協助內質網相關降解（ERAD）［14］。BIP在乳腺癌、前列腺癌、肺癌和肝癌等多種組織和細胞類型的癌癥中過度表達。此外，BIP過度表達與原發性癌細胞的增殖、轉移、耐藥性和化療耐藥性增強及總體臨床結果不佳有關［15-16］。

GO功能富集結果顯示，在細胞組分中，關鍵靶點與核糖核蛋白復合物、蛋白質-DNA 復合物、核斑點、核染色體等有關，主要與組蛋白脫乙酰酶結合、泛素蛋白連接酶結合、激酶結合、轉錄因子結合等分子功能有關。主要靶點涉及調節細胞對壓力的反應、DNA 代謝過程、蛋白質穩定性調節、細胞酰胺代謝的正向調節、核糖體生物發生等多個生物過程。KEGG 功能富集分析結果顯示，浙貝母-山慈菇藥對治療甲狀腺癌所涉及的信號通路包括新型冠狀病毒感染、細胞凋亡、剪接體及HIF-1信號通路和細胞周期、內分泌抵抗、緊密連接、神經營養因子通路、病毒致癌、非同源末端連接、肌萎縮側索硬化、甲狀腺激素信號通路、長壽調節途徑（多物種）、糖酵解／糖異生、癌癥中的轉錄失調、核質轉運、核苷酸切除修復、AMPK 信號通路、mRNA 監測途徑等。其中新型冠狀病毒感染與多種甲狀腺疾病密切相關［17］；HIF-1α通過誘導上皮間質轉化，調節甲狀腺癌細胞的Twist信號通路，進而增加細胞侵襲和細胞遷移［18］。AMPK通路在甲狀腺乳頭狀癌中被高度激活，激活后的AMPK信號通路可抑制甲狀腺癌細胞的增殖活動［19-20］。以上研究結果表明，浙貝母-山慈菇藥對可通過多個靶點調節多條信號通路以發揮其對抗甲狀腺癌的作用。

本研究結果顯示，浙貝母-山慈菇藥對干預甲狀腺癌的機制復雜，其作用機制涉及多個靶點、多條信號通路而形成網狀結構，具有聯合發揮作用的特點。目前甲狀腺癌的發病機制研究尚不明確，治療上西醫多采用手術、放射性碘等方法治療甲狀腺癌，但尚無針對晚期甲狀腺癌有效的治療方法。隨著中醫藥的發展，中藥逐漸應用于甲狀腺癌的治療中。本研究可為中藥治療甲狀腺癌提供新的理論基礎和治療思路，但仍然有局限性，如中藥在臨床應用時多以復方的形式存在，藥物之間的相互作用及腸道菌群等因素影響藥物在腸道的吸收，網絡藥理學研究結果并不能直接指導臨床實踐，后續可進一步進行實驗驗證，發掘浙貝母-山慈菇藥對治療甲狀腺癌的機制，為新藥的研發提供支撐。