益肺湯調控TGF-β1/Smad2通路抗肺纖維化機制研究

鄧祥麗,陳麗娟,邵 梅,吳 梅,楊 梅,吳海茵,馬信文,黃 芬

(1.云南中醫藥大學第一臨床醫學院,云南 昆明 650051;2.云南中醫藥大學第一附屬醫院,云南 昆明 650021)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis,PF)是一種慢性、進行性、年齡相關性的間質性肺疾病,其病理特征為成纖維細胞增殖、細胞外基質沉積(Extracellular matrix,ECM)、肺結構破壞及其功能喪失,臨床主要表現為活動性呼吸困難,呈進行性加重,預后多不良,最終因呼吸衰竭而死亡[1-2]。PF好發于老年人,起病隱匿,屬肺系難治性疾病,其發病率逐年上升,中位生存期僅為3～5年[3]。目前,PF的臨床治療藥物主要是吡非尼酮、尼達尼布,但其療效有限,不良反應也較為明顯[4]。因此,研究PF的發病機制,提供更多的治療方案,是目前PF亟待解決的問題。研究顯示,轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)是PF的重要啟動因子,可激活下游多種Smads蛋白,其中Smad2和Smad3是兩個主要的下游調節劑[5-6]。通過激活Smad通路,介導上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),并誘導成纖維細胞增殖、肌成纖維細胞分化,且分泌大量α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ,Col Ⅰ)、纖維連接蛋白(Fibronectin,FN)等細胞外基質(EJCM)成分,加速PF進程[7-9]。腎素-血管緊張素系統(Renin-angiotensin system,RAS)是重要的體液調節系統,近年來研究顯示RAS和肺損傷關系密切,其中血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)是RAS中的重要效應肽,在PF的發生、進展過程中伴隨著Ang Ⅱ水平的升高[10-11]。

本研究團隊基于多年臨床研究認為肺脾兩虛、氣血失衡是PF的基本病機,研創出益肺湯,治以健脾益肺、調氣活血,在PF患者治療過程中獲得了良好的療效反饋。本研究擬通過體外實驗,Ang Ⅱ誘導大鼠肺成纖維細胞(NIH-3T3)向肌成纖維細胞轉化,觀察TGF-β1/Smad2信號活化在益肺湯抑制肺纖維化中的作用,從調控TGF-β1/Smad2信號通路揭示益肺湯抗肺纖維化的機制,為該方的臨床應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物與細胞:NIH-3T3小鼠胚胎成纖維細胞(批號BNCC339681,北納生物);SPF級C57小鼠[批號SCXK(湘)2016-0002,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司]40只,體重20～25 g,6～8周齡。

1.1.2 主要試劑及儀器:Ang Ⅱ(批號A9525,SIGMA);Rabbit Anti-alpha smooth Actin Polyclonal Antibody(批號bs-10196R,Bioss);辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(批號ZB-2301,中杉金橋);Rabbit Anti-Smad2 Polyclonal Antibody (批號bs-0718R,Bioss);Goat Anti-Rabbit IgG Cy3,Conjugated(批號CW0159S,CWBIO);即用型DAPI染液(批號KGA215-50,凱基);Rabbit Anti-α-SMA (批號bs-10196R,Bioss);Rabbit Anti-FN(批號ab32419,abcam);Rabbit Anti-Col Ⅰ (批號AF7001,Affinity);Rabbit Anti-Smad2 (批號ab40855,abcam);潔凈工作臺(型號BBS-SDC,BIOBASE);顯微鏡(型號CX41,OLYMPUS);蛋白垂直電泳儀(型號DYY-6C,北京六一儀器廠);超高靈敏度化學發光成像系統[型號Chemi DocTM XRS+,(上海)伯樂生命醫學產品有限公司]。

1.2 實驗方法

1.2.1 益肺湯水煎液制備:益肺湯由炙桑白皮、桃仁、炒枳實、桔梗各12 g,生白術10 g,丹參18 g,甘草6 g組成,中藥材購于云南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房;將中藥飲片進行常規煎煮、過濾、真空減壓濃縮,濃縮至生藥含量3 g/ml濃度,分裝,-80 ℃環境下保存、備用。

1.2.2 含藥血清的制備:參照相關文獻制備益肺湯含藥血清[12-13]。40只SPF級C57小鼠適應性飼養1周后,給予益肺湯灌胃,1次/d,連續給藥3 d,給藥劑量11.2 g/(kg·d)。末次給藥后1 h主動脈取血,將所得血清用DMEM配成20%含藥血清溶液,靜置于4 ℃冰箱4 h后2500 r/min離心25 min,分離血清同組混合于56 ℃水浴滅活30 min,0.22 μm濾器過濾,分裝,-20 ℃保存備用。

1.2.3 細胞實驗分組:參考成文媛等[14]前期實驗研究,將40只小鼠適應性飼養1周后,隨機分為正常對照組、模型組、模型+正常血清組、模型+含藥血清組,每組10只。正常對照組:同條件培養更換培養液但不做藥物干預及Ang Ⅱ處理;模型組:使用100 ng/μl的Ang Ⅱ 稀釋液處理細胞;模型+正常血清組:100 ng/μl的Ang Ⅱ誘導+正常組血清10%;模型+含藥血清組:100 ng/μl的Ang Ⅱ誘導+益肺湯含藥血清10%。接種細胞至50%匯合度時模型+正常血清組、模型+含藥血清組按照實驗方案加入血清,處理48 h后,將模型組、模型+正常血清組、模型+含藥血清組換成含有0.1%FBS的培養基饑餓處理24 h,再按照實驗方案,用100 ng/μl的Ang Ⅱ進行誘導。給藥24 h后,給至下游檢測。

1.2.4 免疫組化檢測α-SMA:取4%的多聚甲醛進行樣本固定15 min,PBS浸洗培養皿3次,打孔,0.5%Triton X-100(PBS配制)進行室溫通透20 min。加入新鮮配制的3%雙氧水,室溫孵育10 min,PBS充分淋洗。培養皿內滴加5%BSA,37 ℃封閉30 min。滴加一抗α-SMA(1∶200)至培養皿內,4 ℃孵育過夜。PBS浸洗玻片后滴加聚合HRP標記抗兔IgG二抗工作液,37 ℃孵育30 min,洗滌后DAB顯色,蘇木精復染,封片鏡檢。

1.2.5 免疫熒光檢測Smad2:用4%的多聚甲醛固定樣本15 min,PBS浸洗培養皿,0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min。PBS浸洗,滴加5% BSA,37 ℃封閉30 min。滴加一抗NSE(1∶200),4 ℃孵育過夜。PBS浸洗后滴加熒光二抗Cy3(1∶200),37 ℃孵育30 min,PBS浸洗,滴加DAPI避光孵育5 min,PBS沖洗,封片鏡檢。

1.2.6 Western blot檢測α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2:將各組細胞加入200 μl的RIPA細胞裂解液,充分冰上裂解30 min后,12000 r/min離心10 min,吸取上清液,提取細胞蛋白。按照BCA試劑盒檢測蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠,蛋白變性,上樣,凝膠電泳1～2 h后,300 mA恒流轉膜30～50 min,3%的脫脂牛奶封閉液封閉1 h。PVDF膜孵育一抗,4 ℃過夜,TBST洗膜;二抗溶液中室溫孵育1～2 h,再次洗膜。加入ECL發光液,進行顯影成像。Quantity One分析各條帶灰度值。

1.2.7 ELISA檢測TGF-β1:參照TGF-β1試劑盒說明書,空白孔調零,用450 nm波長進行各孔的吸光度(OD值)測量。根據標準物的濃度、OD值,得到標準曲線的直線回歸方程式,根據此方程式,計算出樣品濃度,然后乘以稀釋倍數,即可獲得樣品實際濃度。

2 結 果

2.1 益肺湯對Ang Ⅱ誘導的NIH-3T3細胞α-SMA表達的影響 免疫組化檢測結果見圖1。棕褐色表示α-SMA蛋白。使用100 ng/μl的Ang Ⅱ對細胞造模后發現α-SMA蛋白表達略上調,使用益肺湯含藥血清干預48 h后造模,α-SMA蛋白表達也會出現上調,但是上調的程度低于模型組。

圖1 免疫組化檢測α-SMA(蘇木精染色,×200)

2.2 益肺湯對Ang Ⅱ誘導的NIH-3T3細胞Smad2蛋白表達的影響 免疫熒光檢測結果見圖2。紅色熒光表示Smad2蛋白。使用100 ng/μl的Ang Ⅱ對細胞造模后發現Smad2蛋白表達上調,使用益肺湯含藥血清干預48 h后造模,Smad2蛋白表達也會出現上調,但是上調的程度低于模型組。

圖2 免疫熒光檢測Smad2(DAPI染色,×200)

2.3 益肺湯對Ang Ⅱ誘導的NIH-3T3細胞α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2表達的影響 Western blot檢測結果見表1(圖3)。與正常對照組比較,模型組α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2表達顯著升高(均P<0.05);與模型組比較,模型+含藥血清組α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2顯著降低(均P<0.05)。

表1 各組α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2表達比較

圖3 Western blot檢測α-SMA、FN、Col Ⅰ、Smad2蛋白水平

2.4 益肺湯對Ang Ⅱ誘導的NIH-3T3細胞TGF-β1表達的影響 ELISA檢測結果見表2。與正常對照組比較,模型組TGF-β1水平顯著升高(P<0.05),與模型組比較,模型+含藥血清組TGF-β1水平低于模型組(P<0.05)。

表2 各組TGF-β1表達比較

3 討 論

PF是一種嚴重的、不可逆的彌漫性肺間質性疾病,是多種間質性肺病的終末期改變,預后較差,發病率、病死率較高[15-16]。PF中醫病名多歸于“肺痿”“肺痹”范疇,病位在肺,與脾相關。“諸氣者,皆屬于肺”,肺主呼吸之氣,脾主運化水谷精氣,此謂“肺為主氣之樞,脾為生氣之源”。脾為后天之本,氣血生化之源,肺脾皆為多氣多血之臟。肺脾經絡相連,五行相生,緊密聯系,共主氣血生成、運行[17-18]。肺脾兩虛,氣血生化不足,肺葉失養,則痿弱不用;氣機失調,氣血失和,津留成痰,血滯成瘀,痰瘀膠結,痹阻肺絡,虛實夾雜,惡性循環,導致病情纏綿難愈。“氣通血活,何患不除”,氣血以流暢、平衡為貴,調理氣血,平衡陰陽,則疾患消除[19]。

本研究團隊立足于氣血,聯系肺脾相關理論,從肺脾同治、氣血同調出發,研創益肺湯。方中炙桑白皮甘寒入肺經,有瀉肺平喘、利水消腫之功;白術、枳實出自《脾胃論》中枳術丸,借五行相生的理論,培土生金,正如《石室秘錄》云:“治肺之法,正治甚難,當轉以治脾,脾氣有養,則土自生金”;“熱在上焦,因咳為肺痿”,形成肺痿的中間環節是虛熱熏灼于肺,肺失清肅而咳,加丹參、桃仁以清熱活血,氣血同治,以奏“疏其血氣,令其條達而致和平”之效;桔梗、甘草寬胸理氣,止咳化痰,且桔梗為“舟楫之藥”,可引諸藥入肺經。全方共奏健脾益肺、調氣活血之功,具有臟腑兼顧、宣降結合、氣血同調之特點,體現了中醫整體觀念。基于本課題前期臨床研究,益肺湯可有效改善PF患者癥狀,延緩PF進展。

持續的炎癥反應、損傷誘發機體啟動抗炎、反復修復,導致成纖維細胞增殖、分化為肌成纖維細胞,α-SMA、Col Ⅰ、FN等細胞外基質在肺內堆積,破壞肺結構,促進PF發生[20]。α-SMA是肌成纖維細胞的標志性蛋白,亦是肌成纖維細胞具有收縮活性的基礎,參與合成Col Ⅰ、FN等細胞外基質成分,其含量可作為判定PF程度的間接指標[21-23]。本研究顯示,WB和免疫熒光顯示,造模后,α-SMA、FN、Col Ⅰ的相對表達均顯著升高。含藥血清干預48 h后造模,α-SMA、FN、Col Ⅰ的相對量較模型組均下降。本研究結果表明,益肺湯可下調α-SMA、FN、Col Ⅰ的表達,抑制Ang Ⅱ誘導NIH-3T3增殖,降低細胞外基質水平,從而改善PF。大量研究結果顯示,TGF-β通路是調控成纖維細胞增殖、活化,促進PF發展的主要信號通路,其中TGF-β1參與調控細胞增生、分化、凋亡、黏附以及運動,是促進ECM過度產生、抑制降解的關鍵細胞因子[24-27]。相關研究表明,肺成纖維細胞中α-SMA的表達受TGF-β的調控,TGF-β1刺激后,細胞中α-SMA的表達上調,且TGF-β1劑量水平與PF進展呈正相關[28]。本研究結果進一步顯示,α-SMA、TGF-β1是導致PF的重要因素,并可能協同參與其形成。TGF-β1可促進Col Ⅰ、FN等ECM合成、過度沉積,促使成纖維細胞過度增殖,肌成纖維細胞大量產生,最終出現肺纖維化[29]。TGF-β1激活Smad信號通路,Smad蛋白家族是TGF-β1下游的細胞內效應器,其中Smad2是Smad家族中的主要活化蛋白之一,磷酸化的Smad2與Smad4結合形成復合體,進入細胞核轉錄促纖維化基因,導致ECM大量積聚,促使纖維化的形成[30-31]。相關研究亦表明,通過抑制TGF-β1/Smads信號通路異常激活可改善Ang Ⅱ誘導的纖維化病變[32]。本研究顯示,Ang Ⅱ誘導的肺成纖維細胞TGF-β1、Smad2表達升高,益肺湯降低了TGF-β1、Smad2的表達,表明益肺湯可通過調控TGF-β1/Smad2信號通路,抑制Ang Ⅱ誘導NIH-3T3的轉化,從而阻止PF進展。

綜上所述,益肺湯通過調控TGF-β1/Smad2信號通路,下調Col Ⅰ、α-SMA、FN的表達,抑制Ang Ⅱ誘導的肌成纖維細胞轉化而發揮其抗肺纖維化的作用。