電針氣海、中極、關元穴改善壓力性尿失禁尿道括約肌線粒體損傷機制研究

楊 明,朱旭東,馬 波,盛夢鈺,蔡曉清,李海濤,邵軼群,葉和松

(1.南京中醫藥大學第二附屬醫院,江蘇 南京 210017;2.沭陽縣中醫院,江蘇 宿遷 223600;3.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437)

壓力性尿失禁(Stress urinary incontinence,SUI)臨床表現為腹壓增加時患者出現漏尿癥狀,發病人群主要為中老年女性。流行病學統計發現,SUI影響著50%以上中老年女性的日常生活[1-2]。該疾病嚴重影響患者的生活質量,給患者心理和生理造成沉重負擔[3-5]。SUI發病機制較為復雜,目前認為SUI的發生主要與尿道括約肌解剖結構異常和功能障礙以及尿道周圍的支撐和附屬結構缺陷有關[6-7]。研究提示,SUI患者盆腔支撐組織中存在線粒體DNA(mtDNA)缺失和重排的累積,且隨著SUI病程的加重而明顯累積[8-9]。同時,線粒體質控(MQC)高效運行的前提需確保線粒體結構和功能的完整,MQC通過協調線粒體動力學的穩定性以保障肌肉細胞的常規活動,因而MQC過程中斷是年齡或其他病因所致尿道括約肌功能障礙的潛在機制[10-11]。mtDNA突變和氧化損傷的累積,促進機體的老化,引起尿道支持結構解剖及功能的異常,最終導致SUI的發生[12]。大量研究報道,針刺干預對SUI有較好的臨床療效,同時相關機制研究亦是如火如荼開展中[13-15],但鮮有關于電針調節盆底組織線粒體動力學從而治療SUI的作用機制研究。

課題組根據江蘇省名中醫顧兆軍主任創立的小腹三針(氣海、中極、關元穴)前期開展了大量的臨床和相關機制研究。臨床研究發現,小腹三針治療可以協調SUI患者膀胱逼尿肌和尿道括約肌功能,提高尿道閉合壓[16-17]。根據代謝組學研究[18],推測電針氣海、中極、關元穴治療SUI的作用機制可能在于對線粒體功能的調控。為了進一步明確電針氣海、中極、關元穴對SUI尿道括約肌線粒體功能的影響,擬通過體內實驗研究論證,探討電針改善SUI尿道括約肌病變的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:SD大鼠,雌性,SPF級,重180～220 g,鼠齡6～8周,購于浙江維通利華實驗動物技術有限公司,生產許可證:SCXK(浙)2019-0002,動物飼養及操作按照南京市第一醫院實驗動物管理規定執行,動物使用許可證號:SYXK(蘇)2021-0007,飼養條件為自然光照,溫度25 ℃,相對濕度70%,上述操作通過該實驗動物倫理委員會批準后實施,倫理號:QWSY-22144271。

1.1.2 實驗試劑:超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(英國Abcam公司,貨號:ab65354、ab118970);琥珀酸脫氫酶(SDH)ELISA試劑盒(百奧萊博公司,貨號:SNM178);2.5%戊二醛(青島捷世康生物科技有限公司,貨號:RY0404);線粒體分離、膜電位、ATP含量相關試劑盒(英國Abcam公司,貨號:ab110171、ab112150和ab83355);RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(英國Abcam公司,貨號:ab288006、ab102536);一抗:線粒體融合素1(Mfn1)、Mfn2、線粒體動力相關蛋白1(Drp1)、線粒體分裂因子(MFF)、沉默信息調節因子1(SIRT1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)和β-actin(英國Abcam公司,貨號:ab221661、ab205236、ab184247、ab129075、ab110304、ab106814和ab8226);二抗:辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(英國Abcam公司,貨號:ab172730)。

1.1.3 實驗儀器:針灸針(型號:0.25 mm×13 mm);電子針療儀(型號:SND-Ⅲ);尿動力學檢測儀(型號:UDS94,加拿大Laborie公司);微量恒流泵(型號:DP-S100,北京歐世盛科技有限公司);流式分析儀(型號:Cytoflex,美國Thermo Scientific);全波長酶標儀(型號:Multiskan Sky High,美國Thermo Fisher Scientific);垂直電泳轉印系統(型號:1658033,美國BIO-RAD);全自動化學發光凝膠成像系統(型號:iBright CL1500,美國Thermo Fisher Scientific);透射電子顯微鏡(型號:H-7650,日本日立)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠造模與分組:50只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、假手術組、電針組、假針組,每組10只。模型組、電針組、假針組參照LIN等[19]造模標準進行大鼠陰道擴張合并雙側卵巢切除造模,具體造模步驟:經10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉成功后的大鼠,取仰臥位并進行固定,向弗萊氏尿管球囊內注入4 ml滅菌用水擴張陰道,導管深度為2～3 cm,行陰道縫合防止導尿管脫落,100 g重物進行垂吊牽拉,持續4 h;第7天對該組大鼠進行雙側卵巢切除;觀察7 d后開展噴嚏試驗,鑒別模型效果。假手術組:麻醉后打開腹腔,游離組織并找到卵巢,但不予摘除,然后縫合腹腔,與模型組給予相同的條件飼養。

1.2.2 干預方法:電針組選取氣海、中極、關元穴進行電針治療,根據《實驗針灸學》[20]定位。大鼠置于治療固定架上,針灸針(0.25 mm×13 mm)斜刺進針3 mm,接電針儀,疏密波,電流強度1～3 mA,頻率2～10 Hz,30 min/次,1次/d,連續治療14 d,治療期間根據大鼠狀態進行電流強度和電壓峰值調整。假針組:針刺氣海、中極、關元穴對照點(氣海、中極、關元穴旁開1 cm),電針條件同電針組。空白組、假手術組及模型組給予同等條件置于治療固定架,不進行任何處理。各組均使用0.9%NaCl溶液進行膀胱灌腸測定充盈性膀胱壓力。治療結束后取大鼠尿道括約肌組織。

1.2.3 尿流動力學檢測:麻醉成功后的大鼠進行操作區域無菌消毒,排空大鼠膀胱,0.7 mm輸液導管潤滑后插入膀胱,三通連接微量灌注泵(流量:0.3 ml/min)泵入滅菌用水和尿動力學檢測儀開機檢測。記錄漏尿點壓力(Leak point pressure,LPP)、最大膀胱容量(Maximal bladder capacity,MBC)和腹腔漏尿點壓力(Abdominal leak point pressure,ALPP),重復2次操作,取平均值。

1.2.4 HE染色觀察尿道括約肌形態:干預結束后處死大鼠,獲取尿道括約肌組織,部分組織進行甲醛固定,制片。根據HE染色步驟按試劑盒逐步操作,顯微鏡下觀察尿道括約肌病理形態的改變。

1.2.5 尿道括約肌線粒體功能檢測:干預結束后,大鼠麻醉后主動脈放血處死,獲取尿道括約肌組織,制備組織勻漿,利用線粒體分離試劑盒提取純化尿道括約肌線粒體,并根據試劑盒說明書步驟檢測線粒體膜電位(ΔΨm)和ATP水平。

1.2.6 尿道括約肌氧化應激指標檢測:取凍存尿道括約肌組織制備組織勻漿,取上清液經ELISA試劑盒檢測SOD、MDA及SDH含量,觀察尿道括約肌的氧化應激狀態。

1.2.7 尿道括約肌線粒體形態觀察:尿道括約肌組織經歷戊二醛固定、磷酸漂洗、鋨酸固定、脫水、包埋、固化、制片和染色等相關過程,電鏡觀察線粒體形態改變。

1.2.8 Western blot檢測線粒體動力學相關蛋白:取尿道括約肌組織制備組織勻漿,RIPA混合裂解液裂解、分離,收集上清液。BCA試劑盒測定總蛋白濃度,主要步驟如下:20 μg蛋白孔上樣,凝膠電泳進行蛋白分離2 h,分離后的蛋白轉移至PVDF膜,脫脂牛奶封閉、TBST漂洗,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h。顯影,采集圖片并使用Image J對條帶進行灰度分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠尿動力學指標比較 空白組和假手術組大鼠ALPP、LPP、MBC比較差異無統計學意義(均P>0.05)。與假手術組比較,模型組、假針組和電針組大鼠上述三項指標顯著降低(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述三項指標比較差異無統計學意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠上述三項指標水平顯著升高(均P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠尿動力學指標比較

2.2 各組大鼠尿道括約肌組織形態變化 HE染色結果見圖1。假手術組大鼠尿道括約肌肌纖維排列有序、完整,周圍組織排列連續、致密;模型組肌纖維數量減少、變薄、排列無序,周圍組織顯著增多且疏松;假針組與模型組肌纖維及周圍組織形態無差異;電針組肌纖維增多、變厚、排列較有序,周圍組織減少,排列較致密,基本恢復正常。

圖1 各組大鼠尿道括約肌組織病理學改變(HE染色,×200)

2.3 各組大鼠尿道括約肌ATP含量及線粒體膜電位比較 空白組與假手術組大鼠尿道括約肌ATP含量和線粒體膜電位比較差異無統計學意義(均P>0.05)。與假手術組比較,模型組、電針組、假針組大鼠上述兩項指標顯著降低(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述兩項指標比較差異無統計學意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠ATP含量及線粒體膜電位顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠尿道括約肌ATP含量及線粒體膜電位比較

2.4 各組大鼠尿道括約肌氧化應激指標比較 空白組與假手術組大鼠尿道括約肌SDH和SOD活性及MDA水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。與假手術組比較,模型組、電針組、假針組大鼠SDH和SOD活性顯著降低(均P<0.05),MDA水平顯著升高(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述三項指標比較差異無統計學意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠SDH和SOD活性顯著升高(均P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠尿道括約肌SDH、SOD和MDA含量比較

2.5 各組大鼠尿道括約肌線粒體超微結構改變 電鏡下各組大鼠尿道括約肌線粒體結構顯示,手術解剖操作并未對尿道括約肌線粒體形態有任何影響,SUI可顯著導致尿道括約肌線粒體形態腫脹紊亂和部分空泡化。電針氣海、中極、關元穴可顯著改善SUI尿道括約肌線粒體形態腫脹紊亂和部分空泡化情況。見圖2。

圖2 各組大鼠尿道括約肌線粒體形態(×100)

2.6 各組大鼠尿道括約肌線粒體生物發生信號分子表達比較 空白組與假手術組大鼠尿道括約肌Mfn1、Mfn2、Drp1、MFF、SIRT1和PGC-1α蛋白表達比較差異無統計學意義(均P>0.05)。與假手術組比較,模型組、假針組和電針組大鼠Mfn1、Mfn2、SIRT1和PGC-1α蛋白表達顯著降低(均P<0.05),Drp1和MFF蛋白顯著升高(均P<0.05)。模型組與假針組大鼠上述蛋白表達水平比較差異無統計學意義(均P>0.05)。與模型組比較,電針組大鼠尿道括約肌Mfn1、Mfn2、SIRT1和PGC-1α蛋白表達水平顯著升高(均P<0.01),Drp1和MFF蛋白顯著降低(均P<0.01)。見表4(圖3)。

A:空白組;B:假手術組;C:模型組;D:假針組;E:電針組圖3 電針對SUI環境下尿道括約肌PGC-1α、SIRT1、Mfn1、Mfn2、Drp1和MFF蛋白表達的影響

表4 各組大鼠尿道括約肌PGC-1α、SIRT1、Mfn1、Mfn2、Drp1和MFF蛋白表達比較

3 討 論

在古籍中,并沒有關于SUI的確切名稱,但從腹壓增大時出現尿液漏出的癥狀來看,SUI可歸類為“小便不禁”“遺溺”“膀胱咳”等[21]。SUI多發生在中老年女性人群,故該病機多為脾腎不足,肺氣虛弱,膀胱氣化失司,其病位主要在腎、膀胱,與脾肺相關。顧兆軍教授根據多年的臨床經驗,基于“固本培元、溫腎止遺”理論創立小腹三針(氣海、中極和關元穴)[22]。中極穴下方散布著髂腹下神經分支,髂腹下神經對膀胱和直腸有著重要的支配作用,因此,針刺該穴位能夠改善膀胱功能,緩解小便功能障礙[23]。

前期研究結果提示,針灸治療參與調控SUI患者線粒體代謝平衡。線粒體是細胞的動力工廠,是一種雙膜細胞器,為細胞的各項活動提供ATP,線粒體功能的平衡對于肌肉功能的維持尤為重要[24]。首先,肌肉維持節律性收縮需要線粒體持續地提供足夠的ATP為其發揮生理功能;此外,肌肉細胞根據外界細胞因子或信號刺激迅速調節代謝功能狀態,這需要線粒體保持穩定的功能[25]。尿道括約肌屬于人體骨骼肌的一部分,其線粒體功能對肌肉功能的維持具有顯著的影響。但研究表明,骨骼肌損傷后,線粒體自噬通量減少,這會導致蛋白損傷和細胞器的累積,誘發過度炎癥[26]。由此可以推斷,尿道括約肌線粒體功能障礙或許與SUI病變的發生發展關系密切。

線粒體功能障礙的主要表現之一為線粒體膜電位的破壞,其膜電位的消散一般早于其他凋亡表現,標志著細胞凋亡事件的早期啟動,一旦細胞開始進入凋亡狀態,就會導致大量的能量損傷,從而促發線粒體膜電位顯著降低[27]。中醫藥調控線粒體功能障礙的研究亦取得顯著臨床療效和機制研究成果[28]。本次研究結果顯示,模型組中氧化應激相關指標較空白組顯著改善,結果提示,氧化應激啟動細胞凋亡促進SUI疾病的發生。與模型組比較,電針組線粒體膜電位、SDH、SOD活性及MDA水平顯著升高,提示電針能改善SUI環境下尿道括約肌細胞的線粒體功能障礙,調節氧化應激,抑制細胞凋亡。以上研究結果提示,SUI環境下尿道括約肌細胞的線粒體功能障礙,促進氧化應激及細胞凋亡啟動,而電針可部分逆轉上述效應。

線粒體動力學主要的調控因子包括Mfn1、Mfn2、Drp1、MFF、SIRT1和PGC-1α等,上述調控因子共同調控線粒體的分裂和融合,進而調控線粒體功能和形態的改變[29]。本研究通過電鏡觀察尿道括約肌線粒體微觀結構改變,手術解剖并未對線粒體形態有明顯影響,而SUI模型中線粒體形態腫脹嚴重,線粒體內間隙顯著增寬、嵴走向明顯不規則,PGC-1α和Mfn1、Mfn2和SIRT1蛋白表達顯著降低,而Drp1和MFF蛋白表達顯著升高;電針組線粒體腫脹程度顯著改善,線粒體內間隙增寬、嵴走向不規則情況顯著降低,模型組上述6種蛋白的表達得到部分逆轉;上述研究結果提示,電針可改善SUI環境下尿道括約肌細胞的線粒體形態的病理學改變與功能損傷。

綜上所述,SUI可導致尿道括約肌細胞的線粒體形態的病理學改變與功能損傷。電針可通過改善SUI尿道括約肌線粒體功能和形態的相關表達因子和蛋白,從而改善線粒體的形態與功能障礙,進而改善SUI尿道括約肌病變。