基于JAK2/STAT3通路研究周氏固金消瘤湯含藥血清對人肺腺癌A549細胞侵襲遷移能力的影響

文 靜,王理槐,侯 超

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院,湖南 長沙 410007;2.深圳市中醫院,廣東 深圳 518033)

世界衛生組織國際癌癥研究機構(IARC)發布的全球癌癥統計數據顯示,肺癌占2020年全球新發癌癥病例的11.4%,位居第二,但其病死率位居首位[1-2]。非小細胞肺癌是肺癌最常見的組織學類型[3-4]。腫瘤的侵襲轉移是腫瘤發展過程中最具危險性的階段,是造成患者死亡的主因,因而抑制肺癌侵襲轉移一直是治療研究的重點。腫瘤的侵襲轉移級聯過程涉及克隆形成、上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)缺失、細胞外基質降解、細胞運動、血管生成等多個步驟,大量信號通路參與調節腫瘤侵襲過程,如JAK/STAT3通路的激活能通過促進EMT,進而增強腫瘤侵襲轉移能力[5-6]。張雅麗等[7]研究通過抑制JAK3/STAT6信號通路,從而抑制肺癌細胞增殖、侵襲、轉移和血管生成。有研究證實中藥能夠抑制肺癌大鼠腫瘤進展,促進腫瘤細胞凋亡,其機制可能與調節JAK/STAT通路有關[8-9]。中醫認為腫瘤病機以虛為本,邪實為標,痰瘀互結,邪毒內阻,發為本病,其中氣虛痰阻證多見,治宜益氣化痰[10],治療時權衡標本虛實之輕重,施以化痰、清熱、補虛之法[11]。陳虹宇等[12]探討益氣除痰法治療非小細胞肺癌的療效,發現益氣除痰方能通過多靶點、多途徑逆轉EMT、血管生成等,進而抑制非小細胞肺癌的侵襲轉移。周氏固金消瘤湯(ZSGJXLT)作為國醫大師周岱翰教授治療肺癌的經驗方,有益氣除痰、化瘀解毒、軟堅散結的功效。前期研究發現ZSGJXLT對人肺腺癌荷瘤裸鼠有顯著抑瘤作用[13]。為證實ZSGJXLT的抗肺癌侵襲轉移活性,本研究擬采用血清藥理學方法,基于JAK2/STAT3信號通路對ZSGJXLT抑制肺癌侵襲轉移的藥效機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:40只SD大鼠,SPF級,雄性,6～8周齡,體重(225±25)g,揚州大學比較醫學中心提供,許可證號:SCXK(蘇)2017-0007。本研究經揚州大學動物倫理審查委員會批準(YXYLL-2020-110)。

1.1.2 實驗試劑:CCK-8試劑盒(批號NM598,同仁化學研究所);超敏ECL化學反應發光試劑盒(批號19091716,新賽美生物科技有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號23225,上海碧云天生物技術有限公司);p-STAT3(批號9145,美國CST公司);STAT3(批號12640,美國CST公司);p-JAK2(批號4406,美國CST公司);JAK2(批號3230,美國CST公司);β-actin抗體(批號4970,美國CST公司);N-cadherin(4)、E-cadherin(6)及HRP標記二抗(批號7074,美國CST公司);MMP-2(批號M01263224,萬類生物科技有限公司);MMP-9(批號M01193096,萬類生物科技有限公司);VEGFA抗體(批號AF5131,美國Affinity Biosciences公司);基質膠(批號356234,美國康寧公司);Transwell小室(批號3413,美國康寧公司)。

1.1.3 實驗儀器:CO2細胞培養箱(型號3107,美國Forma scientific公司);高內涵成像系統(型號Operetta CLS,美國Perkin Elmer公司);多功能酶標儀(型號Synergy HTX,美國伯騰儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(型號Ti-U,日本尼康公司);凝膠成像系統(型號ChemiDoc XRS+,美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 周氏固金消瘤湯含藥血清制備:周氏固金消瘤湯由守宮6 g,薏苡仁30 g,人參、生南星各15 g,百部、浙貝母、龍葵各20 g,干蟾皮10 g組成,由揚州市中醫院中藥房提供,按煎藥機規程操作煎煮成湯劑,60 ℃濃縮生藥濃度為3 g/ml,4 ℃冰箱保存備用。SD大鼠適應性喂養1周后,隨機均分為周氏固金消瘤湯(ZSGJXLT)組和空白血清組,每組20只,ZSGJXLT組每日予ZSGJXLT 52 g/kg灌胃,空白血清組每日予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃,2 ml/次,2次/d,連續2周,末次給藥1 h后麻醉,取血,靜置30 min后3000 r/min常溫離心15 min,取上清,56 ℃滅活30 min,無菌微孔濾膜過濾除菌,-80 ℃凍存備用。

1.2.2 細胞培養:人肺腺癌A549細胞株,購于上海中科院細胞庫,培養于1640完全培養基中,置于5%CO2,37 ℃恒溫培養箱中培養,傳代至第3代備用。

1.2.3 CCK-8檢測A549細胞活力:將對數期細胞接種于96孔板(5×103個/孔),分為5%、10%、20%、30%及40% ZSGJXLT含藥血清組,同時設立空白血清組和空白對照組,每組5個復孔,含藥血清及空白血清的總體積分數均為20%,藥物作用12、24、36 h后,加入CCK-8試劑10 μl,孵育1 h后用酶標儀(450 nm波長)測吸光度值(OD)。細胞活性抑制率=(空白血清孔OD-含藥血清孔OD)/(空白血清孔OD-空白孔OD)×100%。

1.2.4 劃痕愈合實驗檢測細胞的二維運動能力:將對數期細胞接種于6孔板(1×106個/ml),細胞過夜貼壁,培養到匯合度約80%,用20 μl槍頭垂直于孔板表面劃痕,PBS洗3次,分別用5%、10%、20% ZSGJXLT含藥血清及空白血清處理細胞24 h,顯微鏡下觀察痕道寬度并拍照,導入Image J軟件中評估細胞劃痕愈合率。

1.2.5 高內涵細胞成像技術觀察細胞的三維運動能力:將對數期細胞接種到96 孔板(2×103個/孔),加入5%、10%、20% ZSGJXLT含藥血清及空白血清,貼壁過夜,將平板放入Operetta CLS高內涵成像系統動態觀察12 h。然后使用Harmony 4.1軟件進行數據采集和分析。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞的侵襲和遷移能力:在進行侵襲/遷移實驗時,Transwell上室分別加入/不加入稀釋基質膠,將對數期細胞接種到Transwell上室(4×104個/孔),培養于100 μl無血清培養基中,下室分別加入5%、10%、20% ZSGJXLT含藥血清及空白血清液0.5 ml,培養箱孵育24 h,取出Transwell小室,棄去培養基,無菌棉簽輕拭去上室殘留細胞,4%多聚甲醛固定上室底面細胞,室溫放置15 min,PBS洗去固定液,結晶紫染色30 min,顯微鏡下觀察并拍照,Image J軟件分析圖像,計算細胞相對侵襲與遷移百分比。

1.2.7 Western blot檢測細胞相關蛋白:取對數生長期的細胞接種于6孔細胞培養板,不同濃度的ZSGJXLT含藥血清及空白血清處理24 h后提取蛋白,取20 μg總蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,冰浴中電壓100 V轉膜2 h,取出PVDF膜,7%脫脂奶粉封閉液封閉1 h,置于一抗稀釋液中,4 ℃脫色搖床上孵育過夜,回收一抗,TBST洗膜3次×15 min,二抗37 ℃孵育2 h后,回收二抗,TBST洗膜3次×15 min,暗房用ECL化學發光法顯影,Image J軟件檢測各蛋白條帶A值,計算目的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學方法 采用Graphpad Prism 9.0統計學軟件進行繪圖和統計學分析。計量資料符合正態分布以均數±標準差表示,組間兩兩比較采用Dunnett’s檢驗,多組間樣本均數比較采用單因素方差分析,計數資料的比較使用卡方檢驗或Fisher確切概率法;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 周氏固金消瘤湯含藥血清可以抑制A549細胞活性 與空白血清組相比,ZSGJXLT含藥血清對A549細胞的活性有顯著抑制作用,與時間及濃度呈正相關性,其中5%、10%、20%、30%與40% ZSGJXLT含藥血清作用A549細胞24 h后,隨著藥物濃度的增加,細胞活性下降。24 h的IC50為25.42%。見表1。

表1 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細胞活性的影響(%)

2.2 周氏固金消瘤湯含藥血清可以抑制A549細胞的劃痕愈合 與空白對照組相比,5% ZSGJXLT(ZSGJXLT低劑量)、10% ZSGJXLT(ZSGJXLT中劑量)、20% ZSGJXLT(ZSGJXLT高劑量)含藥血清作用A549細胞后,細胞劃痕愈合率均下降,呈濃度依賴性,其中ZSGJXLT中劑量及高劑量組與空白對照組比較差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖1(表2)。

圖1 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細胞劃痕愈合能力的影響(×200)

表2 干預24 h各組A549細胞劃痕愈合率比較(%)

2.3 周氏固金消瘤湯含藥血清可以抑制A549細胞的運動 高內涵細胞成像結果表明,與空白對照組相比,經不同濃度ZSGJXLT含藥血清處理的細胞均方位移隨觀察時間的延長均呈下降趨勢(圖2),細胞移動速度也不同程度下降,其中ZSGJXLT中劑量及高劑量組與空白對照組比較差異有統計學意義(均P<0.05),見表3。細胞位移軌跡(圖3)及實時動態位移圖(圖4)觀察到隨著ZSGJXLT含藥血清濃度的增加,細胞運動能力逐漸下降,呈濃度依賴性。

圖2 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細胞均方位移的影響

圖3 各組A549細胞實時位移軌跡變化

圖4 各組A549細胞實時動態位移圖(×20)

表3 各組A549細胞移動速度比較(mm/s)

2.4 周氏固金消瘤湯含藥血清可以抑制A549細胞的侵襲和遷移能力 與空白對照組比較,ZSGJXLT低劑量、中劑量及高劑量組A549細胞侵襲、遷移數量明顯減少(均P<0.05),而與藥物濃度呈正相關,見表4(圖5、6)。

圖5 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細胞侵襲能力的影響(結晶紫染色,×200)

圖6 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細胞遷移能力的影響(結晶紫染色,×200)

表4 干預24 h各組A549細胞相對侵襲、遷移百分比比較(%)

2.5 周氏固金消瘤湯含藥血清對A549細胞中JAK2/STAT3通路相關蛋白表達的影響 經不同濃度ZSGJXLT含藥血清處理A549細胞24 h后,隨著含藥血清濃度的增加,p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3及VEGFA/β-actin相對表達水平下降,其中ZSGJXLT中劑量及高劑量組與空白對照組比較差異有統計學意義(均P<0.05);MMP-9、MMP-2及N-cadherin表達下降,E-cadherin表達升高,其中ZSGJXLT高劑量組與空白對照組比較差異有統計學意義(均P<0.05)。見表5。

表5 各組細胞中JAK2/STAT3通路相關蛋白相對表達量比較

3 討 論

肺癌相當于中醫古籍中的“息賁”“肺積”等病癥,病機特點為“痰、瘀、毒、虛”,以“虛”“痰”為關鍵病理因素,多因稟賦不足、外感六淫、飲食失調、情志不暢等,致使肺失宣降,氣滯血瘀,津液失布,聚濕成痰,久積成塊。周岱翰教授針對肺癌“脾虛痰濕”關鍵病機,基于“培土生金”理念提出“益氣除痰”為肺癌治療大法[14-15]。周氏固金消瘤湯作為益氣除痰經典方劑,攻補兼施、寒溫并用,治以益氣除痰、解毒消癥,方中薏苡仁、守宮除痰散結為君,人參、百部益氣健脾、潤肺止咳,生南星、龍葵、干蟾皮燥濕化痰、散結解毒,共為臣藥,浙貝母清熱化痰,解毒散結為佐使。臨床研究初步發現ZSGJXLT聯合化療對非小細胞肺癌脾虛痰濕型患者有增效減毒之功[16]。有研究通過小鼠抑瘤實驗驗證了ZSGJXLT的抗肺癌活性[13]。血清藥理學能夠真實反映中藥復方及單體在體內的消化、吸收、代謝及最終產生藥理效應的成分,在藥效機制研究中具有可信度高等優勢[17]。因而ZSGJXLT的血清藥理學研究能為復方的抗肺癌活性提供更具說服力的實驗證據。

惡性腫瘤的侵襲轉移是導致手術、放化療等現代醫學手段失敗的主要原因,因而揭示腫瘤侵襲轉移機制,尋找有效阻斷劑,是延長腫瘤患者生存期的關鍵。大量研究證實中醫藥能通過抑制腫瘤細胞運動、遷移和腫瘤血管生成,調控腫瘤微環境及EMT等途徑逆轉腫瘤侵襲轉移[18]。張亞輝等[19]證實肺巖寧能下調轉錄因子Snail表達抑制人肺腺癌A549細胞EMT發生及侵襲轉移。王鑫[20]證實爪哇黃芩素可影響腫瘤侵襲遷移相關基因,從而抑制腫瘤細胞的侵襲遷移。屈直[21]研究證實二陳湯可以通過多種途徑發揮抑制血管生成、免疫調節、抑制腫瘤侵襲與轉移的作用。

蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信號轉導子及轉錄激活因子(STAT)信號通路參與腫瘤增殖、血管生成、侵襲及轉移等惡性生物學過程,涉及E-cadherin、VEGF等多種細胞因子[22],與諸多惡性腫瘤如非小細胞肺癌等的發生發展關系密切。抑癌因子可通過靶向JAK2/STAT3通路發揮抗肺癌侵襲轉移活性,如SH2B3[23]能通過調控JAK2/STAT3通路,抑制肺癌增殖及EMT等阻礙肺癌細胞遷移。STAT3的異常激活可上調腫瘤血管生成關鍵因子VEGF的表達,如巨噬細胞分泌的IL-1β能通過激活STAT3和NF-κB,上調VEGFA進而促進血管生成[24]。N-cadherin蛋白表達升高及E-cadherin蛋白表達缺失是EMT的主要特征,可使腫瘤獲得侵襲能力[25]。EMT與腫瘤血管生成作為腫瘤侵襲轉移的關鍵環節,均涉及VEGF、MMP-9及MMP-2等共同調控因子,如MMP-9可裂解細胞外基質從而釋放VEGF,VEGF刺激局部產生MMP促使毛細血管進一步延伸侵襲到細胞外基質。

本研究結果顯示,周氏固金消瘤湯含藥血清對JAK2、STAT3總蛋白及其磷酸化蛋白都有抑制作用,下調下游因子VEGFA、N-cadherin、MMP-9、MMP-2蛋白表達,上調E-cadherin蛋白表達,提示復方的抗肺癌侵襲轉移活性可能通過靶向JAK2/STAT3信號通路來實現。同時本研究不足之處在于僅設計了不同濃度的ZSGJXLT含藥血清組,而未設置陽性對照組,無法充分評價該藥物的作用。盡管提到ZSGJXLT通過影響JAK2/STAT3信號通路來發揮作用,但是沒有對具體是如何影響這一通路中的特定分子相互作用進行實驗研究。