基于JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路探究八桂止痛散對脂多糖誘導脊髓星形膠質細胞凋亡的影響

廖承成,尹瑞文,張洪衛,張 爽,李 霞,彭國瑤,聶欣怡

(1.云南中醫藥大學第一臨床醫學院皮膚科,云南 昆明 650021;2.云南中醫藥大學第一臨床醫學院腦病科,云南 昆明 650021)

神經病理性疼痛是由神經系統疾病或損傷引起的慢性繼發性疼痛[1]。神經炎癥與神經病理性疼痛密切相關,炎癥誘導的脊髓神經膠質細胞包括小膠質細胞和星形膠質細胞參與了神經病理性疼痛的發展[2]。小膠質細胞和星形膠質細胞活化與JNK、p38 MAPK活化過程有關,使得MAPK家族成為神經病理性疼痛研究的潛在靶點[3]。八桂止痛散主要由八角楓、透骨草、桂枝以及大黃等組成,具有通絡止痛、活血化瘀之功效,將其應用于神經病理性疼痛治療的研究甚少。八桂止痛膏與此成分相似,其在多種疼痛性疾病療效顯著,具有抗炎、鎮痛等作用[4]。故推測八桂止痛散可能對神經病理性疼痛治療有效,因此文章通過LPS誘導脊髓星形膠質細胞建立細胞損傷模型,觀察八桂止痛散對細胞凋亡、炎癥以及相關機制的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞:自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買SD乳鼠(出生時間短于3 d),合格證號:SCXK(湘)2019-0004,使用碘伏和75%酒精進行小鼠全身消毒,在無菌超凈操作臺上固定,迅速剪掉乳鼠頭顱,置于冰上剪開背側以脊柱為中心的皮膚肌肉,將剪刀從頭側伸入胸腔沿脊柱剪斷肋骨,取出脊柱、剖開腹側椎骨,剝離椎骨,取出脊髓,用無菌剪將脊髓剪切成碎塊,加入胰蛋白酶消化,緩緩吹打混勻,消化30 min后終止消化,吸管吹散至組織塊消失,制備單細胞懸液,離心、去上清液,收集細胞接種于培養瓶中,置于細胞孵育箱中進行培養,待細胞融合度達到90%以上時,再進行消化傳代培養。生長到第3～4代時,可得到成熟且純化度達到90%以上的脊髓星形膠質細胞,使用免疫熒光法染色鑒定。

1.1.2 實驗試劑:Med Chem Express公司提供p38 MAPK激活劑-Anisomycin;上海酶聯科技有限公司提供白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒;碧云天公司提供RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒;Thermo Fisher公司提供GFAP抗體;Abcam公司提供JNK、p38 MAPK、NF-κB p65、p-JNK、p-p38 MAPK和p-NF-κB p65一抗。

1.1.3 實驗儀器:奧林巴斯提供BX53熒光顯微鏡;Tanon提供凝膠成像儀;BIO-RAD提供垂直電泳槽、濕式轉膜槽;美國Molecular公司提供SPECTCA MAX190酶標儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫熒光法染色鑒定星形膠質細胞:在培養板中將爬片用PBS浸洗,多聚甲醛固定、Triton X-100通透,5%正常羊血清封閉,加入GFAP一抗,PBST漂洗,加入合適濃度的熒光標記二抗,滴加50 μl的抗淬滅封片劑(含DAPI)封片,熒光顯微鏡下拍照。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活:將對數生長期的星形膠質細胞制備成5×104/ml的細胞懸液,以每孔100 μl的量接種于96孔板中。24 h后,給藥組分別加入100 μl含不同濃度八桂止痛散(2.5、5、10、20、40、80 mg/ml)的培養液,每個濃度梯度設6個平行孔;對照組每孔加入100 μl培養液。48 h后,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,繼續培養4 h,在酶標儀上測定450 nm波長處OD值,計算細胞存活率。

1.2.3 細胞分組及處理:收集對數生長期的星形膠質細胞,設置對照組、LPS組、LPS+藥物低劑量(藥物-L)組、LPS+藥物中劑量(藥物-M)組、LPS+藥物高劑量(藥物-H)組、LPS+藥物-H+Anisomycin組,其中LPS組根據前期研究及文獻[5]以1 μg/ml的LPS處理細胞;LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組分別以1 μg/ml的LPS處理細胞,24 h后加入5、10、20 mg/ml八桂止痛散培養細胞;LPS+藥物-H+Anisomycin組以1 μg/ml的LPS處理細胞,24 h后加入20 mg/ml八桂止痛散、300 ng/ml Anisomycin同時處理細胞[6];對照組不進行細胞處理,48 h后進行指標檢測。處理結束后收集上述細胞,CCK-8法檢測細胞存活。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:收集細胞,加入0.25%胰酶并放回培養箱中消化,將細胞懸液移至離心管中,每管加入5 μl的FITC染料,避光孵育15 min后,隨后每管加入10 μl的PI染料,避光孵育5 min后,流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平:收集細胞,離心取上清,按照試劑盒要求檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.6 qRT-PCR檢測細胞中JNK、p38 MAPK、NF-κB p65基因水平:PBS洗滌細胞,加入Trizol裂解液,在冰浴環境下裂解,提取總RNA;利用ND-1000分光光度計檢測RNA濃度,按照Fast King RT Kit Fast King cDNA合成試劑盒說明進行逆轉錄,向96孔PCR板中依次加入Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、上游引物、下游引物、cDNA模板以及Nuclease-Free Water,設置PCR循環反應條件,反應結束后,利用2-ΔΔCt分析JNK mRNA、p38 MAPK mRNA、NF-κB p65 mRNA表達。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.7 Western blot檢測JNK/p38 MAPK/NF-κB通路相關蛋白表達水平 每孔細胞(6孔板)中加入500 μl的RIPA裂解液(含50 μl蛋白酶抑制劑),冰浴環境下靜置10 min,用刮刀收集細胞,并檢測蛋白濃度,調整各個樣品的蛋白上樣量,以SDS-PAGE電泳分離,采用濕轉法轉膜,PVDF膜置于5%的牛血清白蛋白中,分別加入JNK、p38 MAPK、NF-κB p65、p-JNK、p-p38 MAPK、p-NF-κB p65一抗,放置4 ℃冰箱中過夜,去除一抗液體,加入二抗,化學發光、顯影、定影后,分析蛋白質條帶的灰度值。

1.3 統計學方法 應用SPSS 26.0統計學軟件分析結果。以均數±標準差表示數據,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較行SNK-q檢驗;P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 星形膠質細胞鑒定 免疫熒光鑒定結果(圖1)顯示,特征基因GFAP陽性表達達到95%以上,表明提取得到的細胞為星形膠質細胞。

圖1 星形膠質細胞的鑒定(×400)

2.2 不同濃度的八桂止痛散對星形膠質細胞存活率的影響 見表2。5、10、20、40 mg/ml八桂止痛散均可抑制星形膠質細胞存活,其中以20 mg/ml八桂止痛散處理時,星形膠質細胞存活率接近50%,將其作為藥物處理的最高濃度,5、10 mg/ml八桂止痛散為低、中濃度進行后續實驗。

表2 不同濃度的八桂止痛散對星形膠質細胞存活率的影響(%)

2.3 八桂止痛散對LPS誘導的星形膠質細胞存活率的影響 與對照組相比,LPS組細胞存活率顯著降低(P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組細胞存活率顯著增加,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組細胞存活率顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組細胞存活率比較(%)

2.4 八桂止痛散對LPS誘導的星形膠質細胞凋亡率的影響 與對照組相比,LPS組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組細胞凋亡率顯著降低,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。見圖2(表4)。

圖2 各組細胞凋亡率變化比較

表4 各組細胞凋亡率比較(%)

2.5 八桂止痛散對LPS誘導的星形膠質細胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影響 與對照組相比,LPS組IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著增加(均P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著增加(均P<0.05)。見表5。

表5 各組細胞IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較(pg/ml)

2.6 八桂止痛散對LPS誘導的星形膠質細胞JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達水平的影響 與對照組相比,LPS組JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達顯著增加(均P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達顯著降低,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達顯著增加(均P<0.05)。見表6。

表6 各組細胞JNK、p38 MAPK、NF-κB p65 mRNA表達水平比較

2.7 八桂止痛散對LPS誘導的星形膠質細胞JNK/p38 MAPK/NF-κB p65通路相關蛋白表達的影響 與對照組相比,LPS組p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達顯著增加(均P<0.05);與LPS組相比,LPS+藥物-L組、LPS+藥物-M組、LPS+藥物-H組p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達顯著降低,具有劑量依賴性(均P<0.05);與LPS+藥物-H組相比,LPS+藥物-H+Anisomycin組p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達顯著增加(均P<0.05)。見表7(圖3)。

A:對照組;B:LPS組;C:LPS+藥物-L組;D:LPS+藥物-M組;E:LPS+藥物-H組;F:LPS+藥物-H+Anisomycin組圖3 各組細胞JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達電泳圖

表7 各組細胞p-JNK/JNK、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65表達比較

3 討 論

神經病理性疼痛通常是由損傷和損害神經系統的疾病引起慢性疼痛綜合征,以自發性疼痛、感覺異常、痛覺過敏為特點[7-8]。脊髓星形膠質細胞是中樞神經系統中的一種常駐免疫細胞,周圍神經一旦損傷后,脊髓星形膠質細胞被激活并分泌大量炎癥和神經遞質介質,使神經元致敏,加重中樞致敏作用,在神經病理性疼痛發病機制中起著關鍵作用[8-9]。該疾病嚴重影響患者生活質量,但是由于目前對其發生機制了解不夠深入,尚無有效治療方法[10-11],因此需深入探索其機制以獲取有效治療藥物。

神經病理性疼痛常見于脊髓損傷患者中,但目前抗炎、鎮痛藥物對該疾病的治療具有極大抗性,故尋找有效治療方案意義重大[12]。八桂止痛散主要由八角楓、透骨草、桂枝以及大黃等成分組成,其中大黃味苦,性寒,具有活血祛瘀、清熱解毒、止血、瀉火等功效,可發揮抗病毒、抗炎等作用[13];透骨草味辛、甘,具舒筋活絡、祛風除濕特點,主要表現鎮痛、抗炎的療效,與大黃同為臣藥[14-15];桂枝、八角楓其味辛、性溫,其功效為溫通經絡、發汗解表,具有鎮痛、解熱、抗炎等作用[16-17];全方可發揮通絡止痛、破氣行血等功效[18]。本研究通過對藥物濃度篩選,分別確定了八桂止痛散的低、中、高濃度,并進行后續實驗探索;結果發現八桂止痛散可有效提高細胞存活率,抑制其凋亡,降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平,具有劑量依賴性,表明八桂止痛散可通過降低炎癥抑制LPS誘導的星形膠質細胞凋亡,提高細胞活力,有望在神經病理性疼痛中發揮作用。此外,八桂止痛散與八桂止痛膏成分相似,且已有文獻報道,八桂止痛膏在帶狀皰疹后遺神經痛、二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗中均表現出明顯的抗炎、止痛效果[19-20],故推測八桂止痛散也具有相似藥理作用。

MAPK是一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶,可通過蛋白質磷酸化調節轉錄和翻譯,當MAPK家族被激活時,可激活脊髓背角小膠質細胞和星形膠質細胞活性,增加炎性因子的合成和釋放,增強神經元的興奮性、中樞敏化、興奮性突觸傳遞,引發痛覺過敏和異常性疼痛,因此MAPK通路與神經病理性疼痛息息相關[21-22]。MAPK被認為是啟動NF-κB激活的經典途徑,NF-κB的激活可能有助于促炎細胞因子分泌[23-24]。故推測JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路可能與神經病理性疼痛的發生相關。結果顯示,LPS誘導的星形膠質細胞中,JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路被激活并釋放炎性因子,提示激活JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路可能參與神經病理性疼痛發生發展。亥茅酚苷通過抑制JNK/p38 MAPK和NF-κB信號通路,使得促炎細胞因子減少,緩解了機械性異常性疼痛[25]。本研究發現八桂止痛散可抑制LPS誘導的脊髓星形膠質細胞中JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路激活,降低炎癥反應及細胞凋亡,減輕脊髓星形膠質細胞受損。最后實驗以通路抑制劑-Anisomycin進行反向驗證,結果發現Anisomycin逆轉了八桂止痛散對LPS誘導的脊髓星形膠質細胞保護作用,表明八桂止痛散可能通過抑制JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路發揮作用。

綜上所述,八桂止痛散可抑制LPS誘導的脊髓星形膠質細胞凋亡,降低炎癥反應,可能與抑制JNK/p38 MAPK/NF-κB信號通路有關。