祛風(fēng)止痙膠囊對(duì)支氣管哮喘大鼠氣道炎癥及TRPV1通路的影響

武玉剛,朱玉龍,馬紅霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830000)

哮喘是呼吸系統(tǒng)疾病中常見的慢性氣道炎癥性疾病之一,近年來哮喘的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)[1]。支氣管哮喘最主要的臨床表現(xiàn)是氣道高反應(yīng),目前對(duì)于哮喘的治療分為急性發(fā)作期與緩解期,急性發(fā)作期以糖皮質(zhì)激素及短效β2受體激動(dòng)劑為主,雖然癥狀改善明顯,但伴隨而來的真菌感染及代謝紊亂等不良反應(yīng)不容忽視。支氣管哮喘在中醫(yī)稱為“哮病”。哮病的基本病機(jī)為“伏痰”,外邪侵襲是其主要病因,外邪犯肺而致痰隨氣升,氣因痰阻,相互搏結(jié),壅塞氣道,從而痰鳴如吼,氣息喘促,“風(fēng)邪”是其主要誘發(fā)因素[2]。因此,在哮病的治療上,朱丹溪等古代醫(yī)家也早已提出了祛風(fēng)止痙法。祛風(fēng)止痙方是李風(fēng)森教授基于多年治療哮喘的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成。本研究通過觀察支氣管哮喘大鼠予祛風(fēng)止痙膠囊灌胃后瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1(TRPV1)蛋白分子表達(dá)變化以及外周血白介素(IL)-4、IL-13、IL-5、IL-17水平的變化,進(jìn)一步揭示祛風(fēng)止痙膠囊對(duì)哮喘大鼠TRPV1蛋白分子表達(dá)的影響,研究支氣管哮喘炎癥因子與TRPV1蛋白的相互關(guān)系,為進(jìn)一步研究祛風(fēng)止痙膠囊治療哮喘的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:健康雄性Wister大鼠60只,體重180～220 g,8～10周齡,均由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,建造大鼠哮喘模型,將50只哮喘大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽性對(duì)照組和祛風(fēng)止痙膠囊低劑量組、中劑量組、高劑量組。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑:祛風(fēng)止痙膠囊(白僵蠶、蟬衣、地龍)由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院藥研室提供,將藥物加蒸餾水混合均勻并配制成所需濃度,呈混懸液狀備用。卵蛋白(批號(hào)20180709,美國(guó)sigma公司);TRPV1抗體試劑盒(批號(hào)04913850001,Affinity公司);IL-17A ELISA試劑盒(批號(hào)15596-026,NeoBioscience公司);IL-5 ELISA試劑盒(批號(hào)AB5370,Abcam公司);IL-4 ELISA試劑盒(批號(hào)CK-E20011M,Raybiotech公司);HRP結(jié)合二抗(批號(hào)D60029,中杉金橋公司);瓊脂糖(批號(hào)A610013-0250,上海生工)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:冷凍離心機(jī)(型號(hào)Heraeus Multifuge X1R,賽默飛世爾科技公司);漩渦混合器(型號(hào)GL-88B,海門市其林貝爾儀器制造有限公司);超微量分光光度儀(型號(hào)Tnano701,上海凈信);電泳儀電源(型號(hào)BG-Power600,濟(jì)南歐萊寶生物技術(shù)有限公司);垂直電泳槽(PROTEAN Tetra,濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司);凝膠成像儀(HD-HN1100,山東環(huán)美分析儀器有限公司);PCR儀(型號(hào)MyCycler Thermal Cycler,美國(guó)Bio-Rad);Real Time instrument(型號(hào)ABI 7500Fast);電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)KD-8D,上海精宏)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 哮喘模型的建立:采用腹腔注射OVA致敏、連續(xù)6次呼吸道霧化吸入OVA誘導(dǎo)氣道變應(yīng)性炎癥[3]。實(shí)驗(yàn)第1天,臨時(shí)配制10%OVA溶液,大鼠腹腔注射1 ml以致敏,第15天將致敏的大鼠于透明玻璃罩內(nèi),給予1%OVA溶液進(jìn)行超聲霧化(霧化量由小到大)15 s,然后自然吸入15 s,出現(xiàn)呼吸頻率加快、點(diǎn)頭呼吸、咳嗽、抽搐等癥狀時(shí)為引喘成功。此后,每隔1 d以1%OVA溶液誘導(dǎo),按最大霧量,自然吸入15～30 s,使哮喘反復(fù)發(fā)作,連續(xù)8 d(共4次)。

1.2.2 給藥:高劑量組(1.6 g/ml)、中劑量組(0.5 g/ml)、低劑量組(0.2 g/ml)分別給予中藥混懸液4 ml/次,連續(xù)灌藥10 d,每日1次[4]。正常組不給予任何藥物干預(yù),正常飼養(yǎng)。陽性對(duì)照組予布地奈德混懸液1 mg/kg,連續(xù)霧化10 d,每日1次。模型組:給予0.9%氯化鈉溶液10 ml超聲霧化,連續(xù)霧化10 d,每日1次。干預(yù)第10天,各組大鼠處死取材。

1.2.3 標(biāo)本采集:①大鼠處死并取腹主動(dòng)脈血,將血置于EDTA抗凝管中,其中取2 ml無抗凝血置于4 ℃低溫水平離心機(jī)中,離心后取上清液并置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＂趯⑷⊥暄拇笫髪A閉右肺,經(jīng)氣管插管給予10 ml的0.9%氯化鈉溶液行左肺肺泡灌洗,0.9%氯化鈉溶液經(jīng)氣道緩慢注入左肺直至肺慢慢變至蒼白、膨脹,出現(xiàn)阻力后慢慢回收液體,反復(fù)3次后將回收的肺泡灌洗液離心并取上清液標(biāo)記分裝于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。③取右肺中葉肺組織置于10%福爾馬林中固定72 h,脫水,石蠟包埋,切片,乙醇梯度洗脫,蘇木素染色10 min,伊紅染色液染色30 s,梯度酒精脫水,光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織黏膜病理學(xué)改變。

1.2.4 ELISA檢測(cè)大鼠外周血中炎癥因子水平:取大鼠外周血,離心后分離血清,ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中IL-5、IL-4、IL-13及IL-17的含量。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 Western blot檢測(cè)肺組織TRPV1蛋白:將肺組織研碎后加入蛋白裂解液(IP/RIPA),離心取上清,BCA法蛋白定量計(jì)算各蛋白濃度,加入4×蛋白上樣緩沖液100 ℃使蛋白變性。根據(jù)蛋白分子量配制10%分離膠5 ml、5%濃縮膠3 ml,配制電泳液,將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,將PVDF膜依次放置在保鮮膜上鋪展開,將配制好的發(fā)光劑快速均勻的加在4 ℃恒流轉(zhuǎn)膜2 h,配制5%脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗TRPV1(1∶500)與GAPDH(1∶500),置于旋轉(zhuǎn)搖床上4 ℃過夜。TBST漂洗4次,室溫二抗孵育2 h后,TBST漂洗4次,目的條帶加入ECL化學(xué)顯影液,在化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀檢測(cè)蛋白的表達(dá)。將獲得的圖像在Image J分析軟件計(jì)算灰度值。

1.2.6 Real-time PCR檢測(cè)各組肺組織TRPV1 mRNA:從樣本中提取總RNA,電泳檢測(cè)其完整性。使用逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物反向合成cDNA。TRPV1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng):變性95 ℃ 40 s,退火54 ℃ 42 s,延伸68 ℃ 50 s,26個(gè)循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后分析樣品信號(hào)熒光強(qiáng)度測(cè)定的數(shù)據(jù),以2-ΔΔCt法計(jì)算TRPV1 mRNA表達(dá)水平。使用GAPDH作為內(nèi)參,TRPV1-F:5’-AGATCACCAACAGGAAGGGG-3’,TRPV1-R:5’-TAAAGGGAGGAGTGCACTGG-3’,產(chǎn)物大小為125 bp。

1.2.7 觀察大鼠肺組織HE染色病理變化:取材后,標(biāo)本在預(yù)冷的PBS中沖洗干凈,由4%多聚甲醛固定24 h以上,梯度酒精脫水,對(duì)組織行石蠟包埋、切片厚5 μm,常規(guī)脫蠟入水并修復(fù),滴加TRPV1一抗(1∶200),4 ℃冰箱過夜,PBS溶液清洗3次,每次5 min,在組織切片上滴加適量的生物素標(biāo)記山羊抗鼠/兔IgG,37 ℃孵育20 min,PBS溶液清洗3次,每次5 min,在組織切片上滴加適量的辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液,37 ℃孵育20 min,PBS溶液清洗3 次,每次5 min,在組織切片上加入適量新鮮配制的DAB顯色,觀察到棕色結(jié)果停止顯色,脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞及強(qiáng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。驗(yàn)證各組測(cè)量資料是否滿足正常分布和分散,并使用單因子分散分析比較各組測(cè)量資料;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。滿足正態(tài)分布的雙變資料相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。各組大鼠IL-4、IL-13、IL-5、IL-17、TRPV1蛋白及mRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用單因素方差進(jìn)行分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平比較 見表1。模型組IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對(duì)照組的各指標(biāo)水平低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);高劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)水平低于陽性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 各組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平比較

2.2 各組大鼠肺組織TRPV1蛋白表達(dá)比較 見表2(圖1)。陽性對(duì)照組TRPV1蛋白表達(dá)高于正常組(P<0.05);模型組TRPV1蛋白表達(dá)高于中劑量組、低劑量組、陽性對(duì)照組、高劑量組(均P<0.05);高劑量組TRPV1蛋白表達(dá)低于陽性對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A:正常組;B:模型組;C:陽性對(duì)照組;D:低劑量組;E:中劑量組;F:高劑量組圖1 各組大鼠肺組織TRPV1蛋白表達(dá)電泳圖

表2 各組大鼠肺組織TRPV1蛋白表達(dá)比較

2.3 各組大鼠肺組織TRPV1 mRNA表達(dá)比較 見表3。正常組肺組織TRPV1 mRNA表達(dá)低于模型組(P<0.05),陽性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的TRPV1 mRNA表達(dá)低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠肺組織TRPV1 mRNA表達(dá)比較

2.4 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變 見圖2。與正常組比較,模型組大鼠氣道和肺組織中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),氣管黏膜充血水腫,杯狀細(xì)胞增殖,支氣管分泌物增多;與模型組比較,各給藥組大鼠組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕,其中高劑量組減輕最為明顯。20倍光鏡下觀察免疫組化結(jié)果,通過棕色深淺將染色強(qiáng)度分為0～3級(jí),通過陽性細(xì)胞與細(xì)胞核的比值估算陽性率(0～100),最終結(jié)果為染色強(qiáng)度×陽性率,數(shù)值范圍是0～300。

A:正常組;B:模型組;C:陽性對(duì)照組;D:低劑量組;E:中劑量組;F:高劑量組圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)改變(HE染色,×200)

3 討 論

支氣管中的嗜酸性粒細(xì)胞、非對(duì)稱細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞共同組成的呼吸道慢性炎癥為支氣管哮喘,其以反復(fù)發(fā)作的喘息、呼吸急促、胸悶或咳嗽為主要臨床癥狀[5]。支氣管哮喘的發(fā)病機(jī)制目前仍未能明確,與免疫、遺傳、神經(jīng)受體明顯相關(guān)[6]。哮喘是因機(jī)體Th1/Th2失衡引起的,病理特征主要包括氣道炎癥等,其中慢性呼吸道炎癥是哮喘形成的核心因素,也是呼吸道高反應(yīng)性的重要原因[7]。目前哮喘藥物治療的主要手段是抑制呼吸道慢性炎癥因子的釋放。炎癥因子如IL-4、IL-13、IL-5,可在Th2細(xì)胞受到外部刺激時(shí)釋放出來,其中IL-5是調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞增殖、分化、積聚的關(guān)鍵性因子。哮喘患者中IL-5在肺組織大量釋放,誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)或集中于肺組織,從而引起呼吸道炎癥和肺組織病理變化[8]。IL-4可促進(jìn)Th2分化,活化B細(xì)胞,生成免疫球蛋白E(IgE),肥大細(xì)胞脫顆粒,釋放組胺、肝素、白三烯等多種炎癥因子,使得支氣管收縮[9]。IL-4的大量分泌還可抑制Th1細(xì)胞分泌IFN-γ,IFN-γ可以抑制IgE合成,并且調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[10]。IL-4在誘導(dǎo)漿細(xì)胞產(chǎn)生IgE以及上調(diào)肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞中FcRⅠ和MHc Ⅱ類分子的表達(dá)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。IL-4被認(rèn)為是Th2主開關(guān),可在敏性疾病中驅(qū)動(dòng)Th2細(xì)胞產(chǎn)生其他促過敏細(xì)胞因子,如IL-5和IL-13。IL-4促進(jìn)髓系樹突狀細(xì)胞的發(fā)育,并參與Th2細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞向炎癥部位的遷移,IL-4和IL-13均激活B細(xì)胞合成IgE,誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生,觸發(fā)氣道高反應(yīng)性和黏液高分泌。哮喘的發(fā)生發(fā)展除了Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子起主要作用外,Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子包括IL-17也發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。Treg/Th17的免疫失衡也是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制之一。IL-17不僅能募集中性粒細(xì)胞,還作用于嗜酸性粒細(xì)胞增強(qiáng)氣道炎性反應(yīng)[12]。對(duì)于激素抵抗哮喘的中性粒細(xì)胞氣道炎癥,來源于Th17細(xì)胞的IL-17和來源于巨噬細(xì)胞的IL-18和腫瘤壞死因子-α參與了哮喘的發(fā)病[13]。與健康對(duì)照組相比,在哮喘患者的痰液、鼻腔和支氣管活檢以及血清中觀察到IL-17水平升高,IL-17水平較高的患者有更嚴(yán)重的哮喘表型。研究表明,靶向IL-17通路可能對(duì)哮喘有益,由于Th17/IL-17軸的激活增加與吸入糖皮質(zhì)激素敏感性降低相關(guān),靶向IL-17途徑可能逆轉(zhuǎn)吸入性糖皮質(zhì)激素的無反應(yīng)性[14]。

TRPV1是一種非選擇性的陽離子通道,對(duì)鈣離子有高滲透性,并為鈣離子從細(xì)胞器中釋放出來提供通道,從而改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度,調(diào)節(jié)機(jī)體的重要生理過程。TRPV1通道由熱、疼痛、辣椒素等外部刺激物質(zhì)激活,可誘發(fā)鈣類及螺旋體縮氨酸、鈣素基因相關(guān)縮氨酸的釋放,感覺神經(jīng)縮氨酸作用于呼吸道的部分效應(yīng)細(xì)胞(如平滑肌、膽堿神經(jīng)節(jié)、黏液腺等),誘發(fā)細(xì)胞周圍軸突反射、支氣管收縮、蛋白質(zhì)滲出、炎癥細(xì)胞取向等[15-16]。在OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中,TRPV1在肺組織中的表達(dá)顯著升高,其肺泡灌洗液中Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-3、IL-5和IL-13顯著升高,而使用TRPV1抑制劑治療的哮喘小鼠IL-3、IL-5和IL-13顯著降低[17-18]。研究發(fā)現(xiàn),氣道的抗炎作用可能與TRPV1對(duì)氣道上皮細(xì)胞因子和Th2相關(guān)細(xì)胞因子的下調(diào)有關(guān)[19]。

支氣管炎哮喘常在清晨或夜間急性發(fā)作,隨著病程的延長(zhǎng),可能發(fā)生呼吸道變窄[20]。常規(guī)西藥治療雖然能緩解急性發(fā)作癥狀,但隨著病程延長(zhǎng)可產(chǎn)生耐藥性,病情反復(fù),中醫(yī)治療標(biāo)本兼顧,辨證論治,可增強(qiáng)患者的免疫力,減輕急性發(fā)作時(shí)的癥狀,并可減少急性發(fā)作次數(shù)。中醫(yī)治療哮喘遵“急則治其標(biāo)”“緩則治其本”的原則,前中期以強(qiáng)腎益肺、平喘止咳為主[21]。“祛風(fēng)止痙”是歷代醫(yī)家治療哮喘的重要方法,從“風(fēng)”論治,以“疏風(fēng)宣肺、解痙平喘”治療風(fēng)痰哮癥,療效顯著。祛風(fēng)止痙膠囊中蟬蛻、僵蠶、地龍共用可祛風(fēng)止痙,恢復(fù)肺的宣發(fā)肅降功能,從而改善哮喘的臨床癥狀及預(yù)后[22]。中藥蟬蛻性寒涼,《中華臨床中藥學(xué)》中稱其可以“止咳降氣,主治咳嗽氣喘”[23];白僵蠶可息風(fēng)止痙,散結(jié)消痰,醫(yī)風(fēng)邪入體等癥[24];地龍水煎液可抑制呼吸道過敏,抗組胺,改善哮喘患者呼吸道重構(gòu)現(xiàn)象[25]。

在本次實(shí)驗(yàn)中,模型組哮喘大鼠的血清IL-4、IL-13、IL-5、IL-17均高于正常組,陽性對(duì)照組及低、中、高劑量組血清IL-4、IL-13、IL-5、IL-17均低于模型組,進(jìn)一步驗(yàn)證了祛風(fēng)止痙膠囊可降低哮喘大鼠血清細(xì)胞因子IL-4、IL-13、IL-5、IL-17的分泌水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組哮喘大鼠TRPV1蛋白及mRNA表達(dá)高于正常組;陽性對(duì)照組及低、中、高劑量組TRPV1蛋白及mRNA表達(dá)低于模型組,高劑量組的IL-4、IL-13、IL-5、IL-17水平及TRPV1蛋白表達(dá)低于陽性對(duì)照組,進(jìn)一步證明了祛風(fēng)止痙膠囊可降低哮喘大鼠的TRPV1表達(dá)。

綜上所述,祛風(fēng)止痙膠囊可能通過對(duì)哮喘患者Th2炎癥因子的下調(diào),下調(diào)IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平,降低TRPV1表達(dá),從而減輕哮喘的氣道高反應(yīng)性。