黃芪提取物對帕金森病小鼠黑質(zhì)區(qū)白介素-17通路的影響

關勇宇,張廣潤,李海龍,邵菲菲

(1.甘肅中醫(yī)藥大學,甘肅 蘭州 730000;2.甘肅省人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種與年齡相關的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,臨床主要表現(xiàn)為姿勢平衡障礙、肌肉強直、靜止性震顫、動作遲緩等,嚴重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國65歲以上人群PD患病率達1.7%[3-4]。黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性或壞死是PD發(fā)生的主要病理機制,故臨床主要通過服用多巴胺類或多巴胺受體激動劑類藥物治療PD,雖能一定程度上改善患者癥狀,但該療法無法阻斷神經(jīng)元丟失[5]。現(xiàn)代研究證實,神經(jīng)炎癥損傷在PD退行性病變過程中具有主導作用[6],其中輔助性T淋巴細胞17(Th17)合成分泌的促炎介質(zhì)白介素(IL)-17信號通路異常在神經(jīng)退行性病變PD發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色[7]。

中醫(yī)將PD劃為“顫證”范疇,多與肝、脾、腎等臟腑功能有關,肝氣橫逆克伐脾土,脾胃受損會導致中州運行不暢,腸腑功能不通[8]。中醫(yī)學在PD治療方面積累了豐富的經(jīng)驗,多種中草藥可通過多個通路或靶點治療PD等神經(jīng)退行性疾病。黃芪作為一種補氣良藥,具有補腎健脾之功效,同時其活性成分黃芪黃酮、黃芪皂苷、黃芪多糖等均具有良好的抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護等功效[9-11],在保護PD神經(jīng)元方面具有潛在價值[12],但關于黃芪治療PD的具體作用機制和路徑目前尚未完全闡明。本研究以1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導構建的PD小鼠模型為對象,觀察黃芪提取物對模型小鼠的運動功能和IL-17信號通路中抗腫瘤壞死因子受體相關因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)、核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase,COX-2)等蛋白表達水平的影響,以探究黃芪提取物治療PD的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:從湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購買30只8周齡雄性C57BL/6小鼠[許可證:SCXK(湘)2021-0012]為研究對象。小鼠于光照黑暗交替各12 h環(huán)境中適應性喂養(yǎng)7 d,飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)相對濕度控制在50%～60%,溫度24 ℃左右。

1.1.2 實驗試劑:黃芪飲片(批號202306005,云南好醫(yī)生云福中藥飲片有限公司);葡萄糖(批號23B1601,天津鼎盛鑫);黃芪皂苷Ⅳ(批號84687-43-4,天津士蘭科有限公司);蘆丁(批號207671-50-9,上海一基生物);MPTP(批號28289-54-5,百靈威);丙磺舒(批號57-55-9,武漢合中);RIPA裂解液(批號R0010,Solarbio);BCA試劑盒(批號PC0020,北京索萊寶);兔抗IL-17(批號600-401-BU8,武漢艾美捷);兔抗TRAF-6(批號:P4044Rb-h,上海麗臣商貿(mào)有限公司);兔抗NF-κB(批號YT746,北京百奧萊博);兔抗IL-1β(批號103-P11,德國Relia Tech);兔抗IL-6[批號Rab(P)17162,上海圻明生物];兔抗TNF-α(批號103-P35,德國Relia Tech);兔抗COX-2(批號AF-0010,北京鼎國昌盛);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(批號A21020,武漢艾美捷)。

1.1.3 實驗儀器:旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號RE-52,北京歐萊德);真空恒溫干燥箱(型號HE-WD-300,東莞豪恩);紫外分光光度計(型號721,上海赫爾普);轉(zhuǎn)棒疲勞儀(型號ZL-200C,安徽耀坤)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃芪提取物制備:取200 g黃芪飲片,加入1000 ml蒸餾水浸泡30 min,開大火煮沸轉(zhuǎn)中火煎煮30 min,紗布過濾;殘余藥渣再次加500 ml蒸餾水煎煮30 min后過濾;取2次濾液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,于60 ℃條件下水浴濃縮,恒溫干燥箱干燥成粉。以葡萄糖、黃芪皂苷Ⅳ和蘆丁為標準樣品,紫外分光光度法測得黃芪提取物中總黃芪多糖、黃芪皂苷及黃芪黃酮含量分別為64.33%、0.74%和10.35%。提取黃芪干燥物保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實驗分組與建模:將小鼠隨機均分為五組,每組6只。模型組和各濃度黃芪組均腹腔注射MPTP誘導構建PD模型。每日晨起8:30按照30 mg/kg的劑量腹腔注射MPTP試劑,60 min后按照250 mg/kg的劑量注射丙磺舒,1次/d,連續(xù)注射5 d;對照組相同時間內(nèi)腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液。從第6天開始,低、中、高濃度黃芪組分別在相同時間以50、100、200 mg/kg的黃芪提取物對小鼠進行灌胃,1 d/次,連續(xù)灌胃14 d;模型組和對照組則以相同方式以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。末次給藥后次日對小鼠進行轉(zhuǎn)棍實驗和爬桿實驗,斷頭取腦,去掉小鼠頭皮與顱骨,迅速分離出各組小鼠大腦黑質(zhì)組織,-80 ℃保存待用。

1.2.3 小鼠行為表現(xiàn):①轉(zhuǎn)棍實驗。建模前3 d開始,將小鼠置于直徑3 cm轉(zhuǎn)棒儀棍棒上,設置啟動速度為5 r/min,從起始轉(zhuǎn)速增加至15 r/min,訓練小鼠使之能在最大轉(zhuǎn)速時停留于轉(zhuǎn)棒時間達到120 s。末次灌胃后次日測試三組小鼠在轉(zhuǎn)速為15 r/min時于棍棒上保持時間,記為掉落潛伏期,每只小鼠做3次,取平均值;最后采用梯形算法計算三組小鼠總體棍棒評分。②爬桿實驗。選擇直徑1 cm、高度50 cm、頂端帶有直徑3 cm圓球的爬桿,爬桿具有防滑處理。于建模前1 d將小鼠置于圓球上,觀察小鼠頭向下時間(T1),若其在圓球上停留時間超過30 s,則引導小鼠沿桿向下爬行,記錄小鼠由桿頂爬至桿底所用時間(T-LA),重復3次。末次灌胃后次日再次測試三組小鼠T1和T-LA。

1.2.4 免疫組化測定酪氨酸羥化酶:分離腦黑質(zhì)致密區(qū)(Substantia nigra pars compact,SNpc)組織,常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片、二甲苯脫蠟、酒精梯度水化,室溫封閉20 min,滴加濃度為1∶100的酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH),4 ℃孵育過夜,添加二抗,室溫孵育90 min,添加新鮮配制的DAB顯色液,顯微鏡下觀察,以棕黃色或棕褐色為陽性表達,計算陽性表達率。

1.2.5 Th17細胞數(shù)目測定:分離SNpc組織,4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片、二甲苯脫蠟、酒精梯度水化、非免疫血清37 ℃封閉20 min后,采用CD4+、RORrt熒光抗體,4 ℃孵育過夜;加入二抗37 ℃條件下孵育90 min,添加DAPI進行細胞核染色,封片。倒置熒光顯微鏡下觀察染色情況,400倍鏡下觀察切片Th17陽性細胞數(shù)目,取連續(xù)10個視野計算平均陽性細胞數(shù)。

1.2.6 Western blot檢測相關蛋白相對表達量:取分離得到小鼠紋狀體腦組織,加入RIPA裂解液,置于冰上做勻漿處理;4 ℃,15000 r/min離心15 min,分離上清液至EP管中。取1 μl上清液,采用BCA試劑盒測定樣品中蛋白質(zhì)濃度;其余部分按照1∶4加入5×加載緩沖液,95 ℃變性5 min,冰上冷卻后電泳,并轉(zhuǎn)至PVDF膜上,10%脫脂奶粉搖床上封閉處理1 h。分別加入IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2一抗和β-actin(內(nèi)參),4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液沖洗3次,5 min/次,加入辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫孵育1 h,TBST沖洗3次,5 min/次,增強化學發(fā)光法顯色。Image-Lab 6.1凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描計算各組小鼠SNpc區(qū)組織中IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,行單因素方差分析后采用LSD檢驗;P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠行為表現(xiàn)情況比較 見表1。與對照組比較,模型組和各濃度黃芪組小鼠轉(zhuǎn)棍掉落潛伏期明顯縮短,爬桿實驗的T1和T-LA明顯延長(均P<0.05)。與模型組比較,各濃度黃芪組小鼠轉(zhuǎn)棍掉落潛伏期明顯延長,爬桿實驗的T1和T-LA明顯縮短(均P<0.05),且黃芪提取物濃度呈劑量依賴性。

表1 各組小鼠行為表現(xiàn)情況比較(s)

2.2 各組小鼠SNpc區(qū)TH表達和Th17細胞數(shù)目比較 見表2。與對照組比較,模型組和各濃度黃芪組小鼠SNpc區(qū)TH表達水平下降,Th17細胞數(shù)目增多(均P<0.05)。與模型組比較,各濃度黃芪組小鼠SNpc區(qū)TH表達水平升高,Th17細胞數(shù)目減少(均P<0.05),且與黃芪提取物濃度呈劑量依賴性。

表2 各組小鼠SNpc區(qū)TH表達和Th17細胞數(shù)目比較

2.3 各組小鼠IL-17、TRAF-6和NF-κB蛋白表達水平比較 見表3。與對照組比較,模型組和各濃度黃芪組小鼠IL-17、TRAF-6和NF-κB蛋白相對表達水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,各濃度黃芪組小鼠IL-17、TRAF-6和NF-κB蛋白相對表達水平下降(均P<0.05),且與黃芪提取物濃度呈劑量依賴性。

表3 各組小鼠IL-17、TRAF-6和NF-κB蛋白表達水平比較

2.4 各組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白表達水平比較 見表4。與對照組比較,模型組和各濃度黃芪組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相對表達水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,各濃度黃芪組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相對表達水平下降(均P<0.05),且與黃芪提取物濃度呈劑量依賴性。

表4 各組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白表達水平比較

3 討 論

小膠質(zhì)細胞異常激活和黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失是PD主要病理改變,然而,關于多巴胺能神經(jīng)元變性壞死的病理機制目前尚未完全明確。目前認為PD發(fā)生與年齡、細胞凋亡、興奮性神經(jīng)毒、氧化應激、免疫炎癥異常等有關[13-14]。現(xiàn)代研究證實,PD存在明顯的免疫炎癥失調(diào),紋狀體炎癥可通過激活小膠質(zhì)細胞,誘導黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡[15]。傳統(tǒng)PD治療以補充多巴胺為主,但長期服用藥物可能會引發(fā)藥物相關性運動波動和運動障礙,而且對神經(jīng)元保護作用不明顯[16]。探究具有神經(jīng)保護作用的PD治療方法成為臨床工作者努力的方向。

黃芪是一種具有補氣固表、補血生肌、利尿排膿等功效的中草藥,其提取物中含有黃芪多糖、黃芪黃酮、黃芪皂苷等多種活性成分,可通過增強機體抗氧化能力,從而維持大腦組織中神經(jīng)細胞完整性,延緩或改善神經(jīng)元的退行性病變[17];同時,可通過降低炎癥細胞激活,減少神經(jīng)細胞凋亡,抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥浸潤和神經(jīng)元的炎癥損傷[18]。現(xiàn)代研究闡明,黃芪提取物可通過多靶位點、多通路發(fā)揮PD治療作用[19-20]。小膠質(zhì)細胞作為大腦組織中固有免疫細胞,與T淋巴細胞、自然殺傷性細胞、白細胞等共同參與神經(jīng)元損傷后免疫反應[21]。研究證實,在PD患者大腦SNpc區(qū)存在明顯CD4+、CD8+T淋巴細胞浸潤現(xiàn)象,T淋巴細胞會損傷血腦屏障,引發(fā)局部特異性免疫反應,從而導致淋巴細胞侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng),引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的免疫性損傷破壞[22]。Th17細胞是CD4+T淋巴細胞經(jīng)抗原提呈刺激后分化而來的T淋巴細胞,可分泌IL-17、TNF-α、IL-21等多種促炎介質(zhì),其中IL-17是Th17細胞的主要效應因子,也是T細胞誘導炎癥反應的早期啟動因子,可通過TRAF6/NF-κB、TRAF6/AP-1、TRAF6/MAPKs/AP-1等多種途徑,啟動IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2等炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄,誘發(fā)局部炎癥性損傷[23]。有關研究表明,敲除IL-17基因可抑制MPTP誘導的小膠質(zhì)細胞激活及其激活后形態(tài)與功能損傷[24]。

本研究通過比較發(fā)現(xiàn),MPTP誘導的PD模型小鼠轉(zhuǎn)棍掉落潛伏期明顯縮短,爬桿實驗的T1和T-LA明顯延長,SNpc區(qū)TH表達水平明顯下降,Th17細胞數(shù)目和IL-17相對表達量明顯升高。說明Th細胞激活和IL-17上調(diào)表達是促進多巴胺神經(jīng)元丟失的重要機制。TRAF6和NF-κB是IL-17信號通路下游必不可少的銜接蛋白,其中TRAF6是ACT1的關鍵底物;NF-κB是與T淋巴細胞發(fā)育、免疫細胞激活、炎癥反應等有關的炎癥轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB激酶抑制物相關激酶與ACT1相互作用,參與IL-17介導的NF-κB激活[25]。IL-17/NF-κB信號通路激活被證實是導致PD神經(jīng)元死亡的重要原因之一[26]。本研究對比顯示,與模型組相比,黃芪組小鼠轉(zhuǎn)棍掉落潛伏期明顯延長,爬桿實驗T1和T-LA明顯縮短,SNpc區(qū)TH表達水平升高,Th17細胞數(shù)目減少,紋狀體區(qū)IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2蛋白相對表達水平明顯下降,提示黃芪提取物可通過抑制IL-17信號通路激活,保護多巴胺能神經(jīng)元的炎癥性凋亡,改善PD小鼠行為表現(xiàn)。此外,本研究結果顯示,黃芪提取物對PD小鼠的影響作用與黃芪提取物濃度顯著相關,隨著黃芪提取物灌胃濃度增加,其對PD小鼠行為表現(xiàn)、SNpc區(qū)TH表達水平、Th17細胞數(shù)目、IL-17、TRAF-6、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2表達水平的影響作用逐漸增強。

綜上所述,黃芪提取物能有效改善PD模型小鼠活動能力,保護SNpc區(qū)TH陽性神經(jīng)元,其機制可能與抑制IL-17/TRAF-6/NF-κB信號通路,減少多巴胺神經(jīng)元的炎癥性損傷凋亡有關。