雞傳染性喉氣管炎病毒微滴式數字PCR定量檢測方法的建立

曾婷婷 黃嬌玲 王盛 李丹 韋悠 李小鳳 任紅玉 阮志華

摘 要 旨在建立檢測雞傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）絕對定量方法。根據已發表的雞ILTV的TK基因序列，針對其保守區域分別設計1 對特異引物和1 條探針，建立檢測雞ILTV的微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）方法，并評價其特異性、敏感性和重復性。結果顯示，建立方法的最佳引物濃度為 20 μmol/μL，最佳探針濃度為10 μmol/μL，最佳退火溫度為56 ℃。特異性檢測結果顯示，建立的方法只檢出ILTV，沒有檢出其他病原株。敏感性檢測結果顯示，采用建立的方法定量檢出ILTV重組質粒標準品的最低限為4.6 拷貝/μL。對3個連續稀釋的pMD18-ILTV重組質粒DNA進行檢測，3次重復檢測結果的變異系數均小于5%。對83份病雞喉拭子、肺及脾組織樣品進行檢測，采用建立的ddPCR檢出ILTV陽性樣品10份，熒光定量PCR檢出ILTV陽性樣品9份，ddPCR的陽性檢出率（12.05%）高于熒光定量PCR的陽性檢出率（10.84%）。結果表明，建立的ddPCR方法定量檢測ILTV特異性強、敏感性高、重復性好，為絕對定量檢測ILTV提供更好的技術支撐。

關鍵詞 雞傳染性喉氣管炎病毒；微滴式數字PCR；定量檢測

雞傳染性喉氣管炎病毒（ infectious laryngotracheitis virus，ILTV）主要感染不同品種的雞，引起雞發生上呼吸道疾病，如流鼻涕、咳嗽等，通常會出現呼吸啰音，嚴重時出現呼吸困難及咳出帶血液的滲出物，蛋雞感染還會引起產蛋下降［1-3］。ILTV一旦感染雞群，傳播速度很快，在很短時間內可導致全部雞感染。ILTV感染除引起雞發病外，還可導致雞特別是雛雞死亡，病死率10%～70%不等，導致的直接經濟損失巨大［4-6］。

近年來，隨著雞場中普遍使用ILTV疫苗進行免疫，雞群中出現大面積暴發ILTV感染的病例有所降低，但仍有ILTV感染病例的發生，主要以呼吸道癥狀為主，特征性的癥狀如咳出帶血液的滲出物較少，所引發的呼吸道癥狀與新城疫、低致病性禽流感、傳染性支氣管炎等表現的呼吸道癥狀類似，單憑臨床癥狀很難作出判斷，需要進一步借助實驗室方法進行確診。目前實驗室常用鑒別診斷ILTV的方法有多種，如普通PCR［7-8］、金標試紙條［9］、熒光定量PCR［10-11］等，這些方法中還沒有一種方法能絕對定量檢測ILTV，尤其是缺乏針對低拷貝數ILTV（如感染早期）的絕對定量檢測方法，因此需要建立一種敏感性好的絕對定量檢測ILTV方法。

微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近幾年發展起來的一種技術，該方法是將反應液通過油包水方式分為獨立的數萬個納米微滴，每個微滴就是一個PCR反應單元，包含一個模板拷貝數，反應結束后讀取逐個微滴的信號，根據統計學方法（泊松分布原理）自動統計反應的陽性微滴與陰性微滴的個數，并根據統計數據得出模板的拷貝數（濃度），從而實現對核酸的絕對定量檢測。目前該技術在很多領域包括動物疫病病原檢測方面已有很多成功應用的案例［12-14］。

本研究以ILTV TK基因序列為靶序列，針對其保守區設計1對引物和1條探針，并在探針的5′端添加FAM熒光基團，在3′端添加 ?BHQ1淬滅基團。通過優化引物濃度、探針濃度和退火溫度等，建立絕對定量檢測ILTV的ddPCR方法，為ILTV的定量檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材? 料

1.1.1 試驗用毒株 雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）北京（BJ）株購自中國獸醫藥品監察所，ILTV K317疫苗株購自廣東永順生物制藥有限公司，ILTV CHP50疫苗株購自南京寧成生物科技有限公司。雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）Mass 41株、雞新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）LaSota株、禽呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）S1133株、H9N2亞型禽流感病毒（H9N2 subtype avian influenza virus，H9N2AIV）066C株由廣西獸醫研究所獸醫生物技術研究室保存［15］。雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum，SP）C79-13株和雞大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）O2株購自中國國家獸醫微生物菌株保藏管理中心。禽腦脊髓炎病毒（Avian encephalomyelitis virus，AEV）Van株、禽偏肺病毒（Avian metapneumonia virus，aMPV）MN-10株、雞滑液囊支原體（Mycoplasma synovial，MS）K1415株、雞毒支原體（Mycoplasma gallinis，MG）S6株由美國康涅狄格洲州立大學Khan教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 Supermix for Probe ddPCR （No dUTP）、droplet generation oil for Probes ddPCR、Droplet Reader Oil、DG8Cartridges、DG8gaskets、Pierceable Foil Heat Seal購自美國Bio-rad公司。EasyPureVirual DNA/RNA Kit、Gel Extration Kit購自北京全式金生物技術有限公司。TIANamp Bacteria DNA kit購自天根生化科技（北京）有限公司。RT-PCR擴增試劑盒、Premix Ex Taq試劑盒、100 bp DNA? Ladder、pMD18-T、大腸桿菌DH5α、T4連接試劑盒、凝膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 試驗用雞胚 試驗用SPF種蛋購自北京勃林格殷格翰維通公司，SPF雞胚由廣西獸醫研究所獸醫生物技術研究室孵化至所需日齡。

1.1.4 主要儀器 微滴生成儀（QX200 Droplet generator）、熱封儀（PX1）、微滴數字讀取儀（QX200 Droplet Reader）、梯度PCR擴增儀（T-100）購自美國Bio-rad公司。熒光PCR儀（quant Studio 5）、分光光度計（Nanodrop 2000）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計與合成 根據已發表的ILTV TK基因（No.S83714.1）保守序列，利用在線https：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/軟件設計ddPCR的引物和探針，應用BLAST在線比對設計的引物和探針序列，經綜合分析后挑選1 對引物和1 條探針，在探針序列的5′端添加FAM熒光基團，3′端添加 ?BHQ1淬滅基團。引物及探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并經HPLC純化，所設計的引物和探針序列見表1。

1.2.2 病毒核酸提取 按EasyPure? Virual DNA/RNA試劑盒說明書提取試驗用病毒株的DNA/RNA，按TIANamp Bacteria DNA kit 說明書提取MS、MG、SP及E.coli的DNA，提取的DNA/RNA直接用于擴增或于-80 ℃保存，備用。

1.2.3 標準模板的制備 用ILTF/ILTR引物擴增ILTV? BJ株的TK基因，擴增產物經電泳后，將含約243 bp的目的片段切下，按凝膠回收試劑盒說明書進行目的片段回收純化，然后與pMD18-T載體連接并轉染到大腸桿菌DH5α中。轉染后的質粒DNA經PCR鑒定并送寶生物工程（大連）有限公司進行序列測定，測序正確的質粒DNA用分光光度儀測定濃度，并按公式計算拷貝數=（濃度×阿伏加德羅常數）/（1個堿基對的平均分子質量×總長度），所得的重組質粒DNA即為標準品，小管分裝并保存于-80 ℃，備用。

1.2.4 ddPCR反應的建立及優化 20 μL反應體系：2×Supermix? 10 μL，5～40 μmol/μL的ILT F/ILT R引物各1 μL，2.5～40 μmol/μL的ILT Pro? 1 μL，標準模板2 μL，加滅菌 ddH2O補足至20 μL。微滴生成：在DG8Cartridges的第二排孔分別加入上述反應液20 μL，第三排每孔加入droplet generation oil 70 μL，蓋上DG8gasket，置微滴生成儀上自動生成微滴于第一排孔。封膜：吸取生成的微滴至96 孔板內，加鋁膜Pierceable Foil Heat Seal置 PX1 熱封儀上，180 ℃? ?10 s進行封膜。PCR擴增：封膜的96 孔板放入PCR擴增儀上進行擴增，反應程序：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，退火溫度為50 ℃ ～60 ℃ 1 min ?（2 ℃/S），共進行40 個循環；98 ℃ 10 min；4 ℃ 結束。數據讀取及分析：反應結束后將96孔板置QX200 Droplet Reader上讀取信號并進行數據分析。

1.2.5 ddPCR特異性測定 將H9N2? AIV、IBV、NDV、aMPV、ARV、AEV的RNA反轉錄為cDNA，然后分別與ILTV BJ、ILTV? K317、ILTV? CHP50、MS、MG、SP、E.coli的DNA加入已優化好的ddPCR反應體系中進行特異性檢測。

1.2.6 ddPCR靈敏性及重復性測定 測定ILTV重組質粒標準品濃度后，以10倍梯度稀釋，為10-3～10-10，每個梯度取2 μL加入已優化好的ddPCR反應體系中，以檢測ddPCR方法的敏感性。同時用同樣的引物探針以及同一模板濃度進行熒光定量PCR檢測，比較兩種方法的敏感性。取10-5～10-7? 3 個連續稀釋的質粒標準品為模板進行3次重復試驗，以檢測ddPCR方法的重復性。

1.2.7 臨床樣品檢測 將2020年5月至2021年12月采集的83份病雞喉拭子、肺及脾組織樣品，分別取肺及脾組織樣品約5 g按1∶8（質量體積比）加入無血清的MDEM培養基進行研磨，喉拭子加入2 mL 無血清的MDEM培養基， ?-70 ℃反復凍融3 次，4 000 r/min離心5? min，取上清，按Easy Pure Virual DNA/RNA說明書步驟提取樣品中的總DNA。用建立的ddPCR方法進行檢測，同時按文獻［10］中熒光定量PCR方法進行檢測，比較兩種檢測方法的檢測效果和符合率。

1.2.8 ILTV分離鑒定驗證 對檢出為ILTV陽性的樣品采用雞胚分離鑒定作進一步驗證，陽性樣品經“1.2.7”步驟離心后，取上清液，用0.22 μm的濾膜過濾。取濾液尿囊膜接種9日齡的SPF雞胚，每胚接0.2 mL，然后置37 ℃恒溫箱中培養，收集24～120 h的死胚和活胚的尿囊膜和尿囊液作為1代分離毒。按照同樣方法繼續傳代至第3代，觀察尿囊膜及胚體的病變，并取第3代雞胚分離毒提取的核酸用文獻［7］中PCR方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 重組質粒標準品的鑒定結果

挑取的重組質粒經PCR鑒定，結果擴增到大小約243 bp的片段，經凝膠回收后送寶生物工程（大連）有限公司進行測序，用MegAlign軟件將測定的序列與ILTV TK基因（No.S83714.1）序列進行Clustal W Method分析，發現測定的序列與ILTV TK基因的相應序列完全一致，將獲得的重組質粒命名為pMD18-ILTV。用分光光度儀測定重組質粒pMD18-ILTV標準品OD260nm/OD280nm的值為1.95，質量濃度為46.5 mg/L，按公式計算拷貝數為1.44×1010拷貝/μL。

2.2 ddPCR反應條件優化結果

由圖1可知，當ILTF/ILTR引物濃度和ILTPro濃度分別為20 μmol/μL和10 μmol/μL時，即ILTF/ILTR終濃度為1 μmol/μL，ILTPro終濃度為0.5 μmol/μL時，陽性微滴信號強，陽性微滴與陰性微滴之間的熒光信號區分明顯，此時的引物、探針濃度為最佳反應濃度。采用最佳引物濃度和探針濃度，退火溫度分別設為50 ℃、51 ℃、52 ℃、54 ℃、55 ℃、56 ℃、57 ℃、58 ℃、 ?60 ℃進行ddPCR反應，結果顯示退火溫度為 ?56 ℃時，陽性微滴信號（顯示為藍色）和陰性微滴信號（顯示為黑色）之間的熒光信號區分明顯，擴增獲得的陽性微滴數最高，因此確定最佳退火溫度為56 ℃。

2.3 優化后的ddPCR反應體系及程序

20 μL反應體系包括2×Supermix 10 μL，20 μmol/μL ILT F/ILTR引物各1 μL，10 μmol/μL ILTPro? 1 μL，模板DNA/RNA 2 μL，用ddH2O 補足至20 μL。反應程序：95 ℃ 10 min；94 ℃? ?30 s，設置退火溫度56 ℃ 1 min ?（2? ℃/s），40個循環；98 ℃ 10 min；4 ℃結束。

2.4 ddPCR方法特異性測試結果

將H9N2AIV、IBV、NDV、aMPV、ARV、AEV的RNA反轉錄為cDNA，然后與ILTV? BJ、ILTV? K317、ILTV? CHP50、MS、MG、SP、E.coli的DNA分別作為模板，采用優化的ddPCR反應體系和反應溫度進行檢測。結果顯示，每孔擴增總微滴的生成量均達10 000以上，且較均衡，說明微滴擴增反應成立。出現陽性微滴的毒株有ILTV BJ、ILTV? K317、ILTV? CHP50，其他毒株無陽性微滴出現（圖1）。表明該方法的特異性較強。

2.5 ddPCR方法靈敏性測定結果

由圖2可知，ddPCR方法檢測重組質粒標準品的最低檢測限為4.6 拷貝/μL（10-8稀釋，圖2-A），而熒光定量PCR方法最低只檢測到10-7稀釋的重組質粒標準品（45.4 拷貝/μL，圖2-B），沒有檢出10-8稀釋的重組質粒標準品。用4個連續稀釋的ILTV重組質粒標準品拷貝數與檢測陽性拷貝數的對數值繪制ddPCR檢測的絕對定量曲線，結果為線性，線性方程為y=-1.06x+ ?8.18，R2值為 0.997? 9。結果見圖3。

2.6 ddPCR方法重復性測定結果

采用3 組不同拷貝數的重組質粒標準品評估ddPCR方法的重復性，結果發現3組3次重復檢測結果的變異系數分別為0.54%、0.53%、 ?2.53%，重復檢測結果的變異系數均小于5%（表2）。表明本方法的重復性良好。

2.7 臨床樣品的檢測結果

對83份病雞喉拭子、肺及脾組織樣品進行檢測，ddPCR方法檢測結果為ILTV陽性的樣品有10份，分別為喉拭子樣品6份、肺組織樣品3份、脾組織樣品1份，檢出拷貝數為25.1～2 266拷貝/μL，陽性檢出率為12.05%（10/83），73份樣品為ILTV陰性。熒光定量PCR檢測結果為ILTV陽性的樣品有9份，分別來自喉拭子樣品6份、肺樣品3份，陽性檢出率為10.84%（9/83），ddPCR方法檢出ILTV的陽性率高于熒光定量PCR方法。部分樣品檢測結果見圖4和表3。

2.8 ILTV分離鑒定驗證結果

對ddPCR檢測為ILTV陽性的10份樣品，其中包含熒光定量PCR檢測為陰性的1份脾樣品，經尿囊膜接種9日齡SPF雞胚，并連續傳代3代。第3 代24 h至120 h的死胚及活胚經剖檢后發現雞胚尿囊膜變厚，膜上出現病毒痘斑，雞胚胚體有出血點。提取第3 代分離毒的核酸，經PCR檢測鑒定，10份都為ILTV陽性，從而進一步驗證ddPCR檢測的準確性。

3 討? 論

ILTV可引起雞發病并導致雞死亡，嚴重危害雞的健康生長。為了有效防控ILTV感染雞，目前最為有效的方法是采用ILTV疫苗進行預防免疫，可以說疫苗免疫在防控ILTV感染中發揮了關鍵作用，但是由于不同疫苗產生的保護力不同，在普遍免疫的情況下，雞群中還時常會出現ILTV感染的情況，其癥狀與IBV、AIV、NDV等病原引起的呼吸道癥狀相似，難以區分，確診需要借助實驗室方法。而實驗室快速檢測鑒別的方法多是采用PCR或熒光定量PCR方法，但這兩種方法在病毒載量較低如ILTV感染早期的情況下，第一時間往往檢測不到病原，因此需要建立一種針對低病毒載量的檢測方法。本研究在ILTV TK基因保守區設計引物，通過對引物濃度及反應條件等進行優化，建立了ILTV? ddPCR檢測方法，滿足了對低拷貝病原檢測的需要，且能絕對定量。特異性檢測結果顯示本方法只檢出ILTV，沒有檢出常見的多種禽病病原且無交叉反應，說明本研究建立的ddPCR方法檢測ILTV是特異的。

在建立ddPCR檢測方法時，引物和探針濃度以及退火溫度是影響ddPCR擴增的關鍵條件，為了獲得更好的擴增效果，必須對所用的引物和探針濃度以及退火溫度進行優化。本研究對引物和探針濃度以及退火溫度進行優化，發現引物和探針終濃度分別為1 μmol/μL和0.5 μmol/μL，即引物與探針濃度比為2∶1，退火溫度為56 ℃時，獲得ILTV陽性微滴信號（藍色）最強，陽性微滴與陰性微滴（黑色）之間區分明顯，說明本研究建立的方法獲得了最佳擴增效果。

ddPCR方法是在熒光定量PCR的基礎上發展而來，且ddPCR方法在定量檢測和靈敏性兩方面要優于熒光定量PCR方法。在定量檢測方面，熒光定量PCR是通過標準曲線及擴增的Ct值來計算出標準品的拷貝數，只能實現相對定量檢測。而ddPCR方法則是通過直接計算反應的微滴數來實現對拷貝數的絕對定量檢測，且受擴增效率的影響較小［16］，檢測的結果較準確。在靈敏性檢測方面，已有很多報道證明ddPCR方法比熒光定量PCR方法靈敏，如劉洋等［17］和石磊等［18］建立的ddPCR檢測方法其靈敏度比熒光定量PCR方法高10倍。本研究經靈敏性檢測也證明了ddPCR檢測方法比熒光定量PCR方法靈敏性高10倍，且從4個10倍倍比稀釋的ILTV重組質粒標準品與測得值的拷貝數對數值之間呈良好的線性關系，進一步說明本研究建立的方法是可靠的。本方法的建立將有助于對低拷貝數如ILTV感染早期的檢測診斷，為準確診斷以及有效防控ILTV感染提供技術支撐。

用本研究建立的ddPCR方法對臨床采集的樣品進行檢測，同時采用熒光定量PCR方法進行對比檢測，比較兩者的符合性。通過對保存的已經確定陰陽性的83份病雞喉拭子、肺組織及脾組織樣品的核酸進行檢測，ddPCR方法檢出ILTV陽性樣品10份，熒光定量PCR方法檢出ILTV陽性樣品9份。對10份ddPCR檢測為ILTV陽性的樣品包含1份熒光定量PCR檢測為陰性的脾樣品采用雞胚增殖檢測驗證，經3代雞胚傳代增殖后，剖檢發現雞胚尿囊膜上出現病毒痘斑，雞胚胚體有出血點。第3代分離毒的核酸經PCR檢測10份樣品均為ILTV陽性，從而進一步佐證了ddPCR方法的檢測靈敏性比熒光定量PCR方法靈敏。雞胚傳代增殖檢測雖然能獲得較準確的檢測結果，但是由于雞胚傳代增殖周期長，對樣品要求高，不能及時快速作出判斷。在快速檢測方法中，能定量檢測ILTV的只有熒光定量PCR方法，而本方法的建立，為絕對定量檢測ILTV提供一種更加靈敏的方法。

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Establishment of Droplet Digital PCR Quantitative Detection Method? for Detection of Infectious Laryngotracheitis? Virus

Abstract The aim of present study is to develop and evaluate a droplet digital PCR （ddPCR） for detection of infectious laryngotracheitis virus（ILTV）. Specific oligonucleotide primers and probe were designed and synthesized to recognize the genomic sequences of the thymidine kinase （TK） gene of ILTV based on published reference sequences of ILTV. After the reaction conditions were? optimized ，the ddPCR was used to detect ILTV with the selected primers and probe. The specificity，sensitivity and reproducibility of ddPCR were subsequently evaluated. The results showed that the optimal concentrations of primers and probe were 20 μmol/μL and 10 μmol/μL，respectively. The annealing temperature was 56 ℃.Only ILTV strains were dectected? with the established? ddPCR，but other avian pathogens in the specificity tests were not detect . The minimum limit for quantitative detection of pMD18-ILTV recombinant plasmid DNA was 4.6 copies/μL. Three independently repeated experiments showed that the coefficients of variation were all less than 5% for detection of the three serially diluted pMD18-ILTV recombinant plasmid. Eighty three samplessuch as throat swabs，lungs and spleens collected from sick chickens were examined. Ten samples were tested positive for ILTV by ddPCR and the positive detection rate was 12.05%. Nine samples were tested positive for ILTV by fluorescent quantitative PCR and the positive detection rate was 10.84%. The sensitivity of ddPCR for the tested samples was slightly higher compared with that of the fluorescent quantitative PCR. The ddPCR described in this study was highly specific，sensitive and reproducible for detection of ILTV. The established ddPCR in our lab may provide an alternative means for absolute quantitative detection of ILTV.

Key words Infectious? laryngotracheitis virus （ILTV）; Droplet digital PCR （ddPCR）; Quantitative detection