不同因素對西藏阿旺綿羊胚胎冷凍與移植效果的影響

虞蓮 王幸栓 卓瑪拉姆 鄧增卓瑪 楊志勇 王嬋 李劍南 雷安民

摘 要 為探究西藏阿旺綿羊推行胚胎移植及胚胎冷凍技術(shù)的可行性，以阿旺綿羊為供體，澳湖羊為受體，探討發(fā)情期內(nèi)不同月份對阿旺綿羊超排效果的影響、不同發(fā)育階段鮮胚和移植數(shù)量對母羊受胎率及產(chǎn)羔率的影響，以及冷凍方法對胚胎移植的影響。結(jié)果顯示：發(fā)情期7月超排組平均可用胚數(shù)（3.95±4.23）顯著低于10月超排組（5.45±4.03）；阿旺綿羊胚胎移植2枚桑椹胚的受體妊娠率最高，達到81.81%，產(chǎn)羔率達 ?57.58%，具有顯著性差異；阿旺綿羊胚胎程序化冷凍組受體妊娠率為35.48%，顯著優(yōu)于玻璃化冷凍組受體妊娠率13.63%。以上結(jié)果表明，西藏推行阿旺綿羊胚胎移植技術(shù)的可行性較高。

關(guān)鍵詞 阿旺綿羊；發(fā)育階段；玻璃化冷凍；程序化冷凍

阿旺綿羊是西藏地區(qū)的主要養(yǎng)殖畜種，以其體格大、產(chǎn)肉多、板皮面積大、適應(yīng)性強等特點，聞名于藏區(qū)內(nèi)外。1970年初至1980年中期，中國先后有多個單位開展了綿羊胚胎移植的試驗研究工作，并先后獲得成功。目前，對于胚胎移植技術(shù)快速擴繁優(yōu)良個體在綿羊上已有較多報道，如小尾寒羊［1］、蒙古羊［2］、杜泊克羊［3］、薩福克［4］、波爾山羊［5］等。2007年，西藏地區(qū)開展綿羊胚胎移植試驗，引進純種綿羊并進行胚胎移植給當?shù)匮颍浦埠笫芴ヂ蕿?8.24%［6］。但西藏地區(qū)尚無對阿旺綿羊胚胎移植及冷凍的報道，結(jié)合國內(nèi)外對綿羊胚胎移植和冷凍的實踐與應(yīng)用，本研究進行西藏阿旺綿羊胚胎移植與胚胎冷凍的嘗試，通過阿旺綿羊的超數(shù)排卵、胚胎冷凍、冷凍胚胎復蘇與移植等技術(shù)鏈的集成示范，構(gòu)建阿旺綿羊冷凍胚胎保種庫，實現(xiàn)阿旺綿羊種質(zhì)資源的有效保存，以利于對其進行保種、擴繁及優(yōu)種推廣工作。

1 材料與方法

1.1 材? 料

供體母羊：年齡2～4周歲的西藏阿旺綿羊母羊168只，均為體格健壯、生殖器官無異常、繁殖正常。受體母羊：育成或經(jīng)產(chǎn)的澳湖羊150只，均體格健康，生殖機能正常。

促卵泡素（FSH）和人絨毛膜促性腺激素（hCG）購自寧波三生生物科技有限公司；前列腺素（PG）、孕馬血清促性腺激素（PMSG）和維生素ADE注射液購自寧波市舒生第二激素廠；孕酮陰道栓CIDR栓購自Pfizer Australia Pty公司；速眠新、陸眠寧和酒精等購自重慶市渝生制藥廠；DPBS購自Gibco公司，胎牛血清FBS（fetal bovine serum）購自Sigma公司等。玻璃化冷凍試劑：Cryotech玻璃化快速冷凍試劑組及冷凍載桿購于廣州尊博醫(yī)療器械有限公司。程序化慢速冷凍試劑購于天津云牧生物科技有限公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、干熱滅菌器、恒溫水浴器、體視鏡、腹腔鏡、程序化冷凍儀CL-8800i（程序化冷凍儀CL-8800i由澳大利亞CRYOLOGIC公司設(shè)計制造）。

1.2 方? 法

1.2.1 超排處理 超排處理示意圖如圖1，以放置陰道栓塞記為第1天。進行發(fā)情鑒定時，用同種阿旺綿羊公羊進行一對一配種，以母羊站立接受爬跨并完成本交過程為止，連續(xù)配種3次～4次，配種間隔8 h～12 h。同時，對供體羊在第15天配種結(jié)束后注射促黃體素釋放激素A3 25 μg，做好標記與記錄。

1.2.2 手術(shù)法采胚 供體阿旺綿羊采用手術(shù)法沖胚，術(shù)前2 d禁食禁水。手術(shù)當日將供體阿旺綿羊保定，麻醉，局部消毒后打開腹腔，首先觀察并記錄左右側(cè)卵巢上的黃體數(shù)及卵泡數(shù)，胚胎回收完畢放置于體視顯微鏡下檢胚。皮膚縫合后，傷口周圍涂抹碘酊，肌注氯前列烯醇（PG）。

1.2.3 胚胎檢查與鑒定 體式顯微鏡下檢查每只供體的回收胚胎，統(tǒng)計數(shù)量后，分別記錄和剔除未受精胚、崩解胚，保留授精存活胚胎，通過胚胎形態(tài)觀察，對其進行等級鑒定。

胚胎鑒定：將每只供體回收胚胎置于20倍～40倍體式顯微鏡下，首先判斷受精及死活情況，再觀察其形態(tài)、均勻度、色調(diào)、分裂球大小、細胞密度、透明帶間隙以及變性情況等，并記錄。根據(jù)胚胎形態(tài)，將胚胎分級（表1），A、B、C級胚胎均為可用胚胎，A、B級胚胎可進行冷凍和移植，C級胚胎可用于鮮胚移植。1.2.4 玻璃化冷凍及解凍 冷凍步驟：將卵或胚胎放入平衡液ES中10 min，然后轉(zhuǎn)移至冷凍液VS混合幾次，將卵或胚胎放置載桿末端，投入液氮，此步驟要求在60～90 s內(nèi)完成。整個過程可在室溫下進行，每次最多操作10枚胚胎，以上液體均提前至少1 h放置于室溫環(huán)境中。

復蘇步驟：將卵或胚胎取出，置入復蘇液TS停留1? min，轉(zhuǎn)移至復蘇液TS∶稀釋液DS= ?1∶1的混合液，停留3 min；之后將胚胎依次放入稀釋液DS、清洗液WS1、清洗液WS2，各自停留2 min；將WS2中恢復形態(tài)的胚胎轉(zhuǎn)移至提前孵育的培養(yǎng)液中。

1.2.5 程序化冷凍及解凍 冷凍步驟：選擇內(nèi)置程序4，運行程序至-7 ℃時，放入胚胎管，停留時間在1 min后誘導植冰；三孔板添加Holding培養(yǎng)液，另外兩孔均為10%甘油冷凍保存液。整個冷凍操作過程中的室溫要求維持在23 ℃以上。

復蘇步驟：凍胚細管取出后，空氣停留10～15 s，將細管浸入37 ℃水浴鍋中，停留15～20 s左右。剪掉細管塞子，將胚胎依次放入6%甘 ?油+0.3 mol/L蔗糖、3%甘油+0.3 mol/L蔗糖和0.3 mol/L蔗糖沖洗，每次停留5 min，再移入Holding培養(yǎng)液內(nèi)停留30 min。觀察胚胎的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)是否完整、能否繼續(xù)發(fā)育的情況，選擇狀態(tài)較好的胚胎進行培養(yǎng)。解凍操作過程中的室溫要求在23 ℃以上。

1.2.6 鮮胚及凍胚移植 凍胚解凍后，觀察凍胚恢復形態(tài)，選擇結(jié)構(gòu)完整的胚胎進行培養(yǎng)。鮮胚及凍胚均采用手術(shù)法植入，受體術(shù)前1 d禁食，肌注陸眠寧0.1? mL/kg，術(shù)部消毒。打開腹腔后，首先確認卵巢黃體發(fā)育情況，將胚胎植入后，皮膚切口用碘酒消毒，根據(jù)切口大小縫合。凍胚解凍后的質(zhì)量評價標準， 參照表1進行胚胎分級鑒定。

1.2.7 受體同期發(fā)情與飼養(yǎng)管理 受體澳湖母羊進行同期發(fā)情處理，如圖2。術(shù)前1 d禁食，第21天手術(shù)移植胚胎。受體在胚胎移植術(shù)后加強飼養(yǎng)管理，注意營養(yǎng)狀況，防止因營養(yǎng)不良而引起胚胎早期死亡。[FL）]

1.2.8 統(tǒng)計分析 采用試驗統(tǒng)計軟件SPSS 20進行方差分析。結(jié)果用“平均值±標準差”的形式表示，以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)情期不同月份對阿旺綿羊超排的影響

由表2可知，阿旺綿羊自然發(fā)情時間普遍集中于7月-10月。阿旺綿羊7月已有40%母羊發(fā)情，10月90%以上母羊發(fā)情。為探究阿旺綿羊發(fā)情期不同月份對超排效果的影響，在阿旺綿羊發(fā)情期7月、10月分別超排48只和120只。7月組均黃體數(shù)（8.89±4.64 vs 8.40± ?4.07）與10月組結(jié)果相對穩(wěn)定；7月組均回收胚數(shù)（5.47± ?4.06 vs? ?6.51±4.16）、胚胎回收率 ?（61.61% vs 77.57%）及可用胚率（72.22% vs 83.69%）等均低于10月組，但無顯著性差異（P＞0.05）。而7月超排組平均可用胚胎數(shù)（3.95±4.23 vs 5.45±4.03）顯著低于10月超排組（P＜0.05）。

2.2 不同胚胎發(fā)育階段及移植胚胎枚數(shù)對胚胎移植效果的影響

2.2.1 阿旺綿羊移植胚胎數(shù)量對受胎率的影響 由表3可知，根據(jù)移植胚胎數(shù)量分為單胚、雙胚兩組，結(jié)果顯示受體妊娠率（50.00% vs? 77.27%）、產(chǎn)羔受體占移植受體比例（50.00% vs? ?71.74%）及胚胎成羔率（50.00% vs 54.55%），雙胚組均略高于單胚組，兩組無顯著性差異（P＞ ?0.05）。

2.2.2 阿旺綿羊移植不同發(fā)育階段胚胎對受胎率的影響 由表4可知，共移植受體澳湖羊54只，移植胚胎98枚，移植兩枚桑椹胚的受體妊娠率較高，達到81.8%，同時其產(chǎn)羔率也相對較高，達到57.58%，與其他組數(shù)據(jù)有顯著性差異（P＜0.05）。當受體澳湖母羊分別移植1枚囊胚或1枚桑椹胚時，受體妊娠率、產(chǎn)羔受體占移植受體比率及胚胎成羔率等均為50%。當移植2枚囊胚的受體妊娠率（50.00% vs 81.8%）、產(chǎn)羔受體占移植受體比率（50.00% vs 81.8%）及胚胎成羔率（50.00% vs 57.58%）顯著低于移植2枚桑椹胚，結(jié)果差異顯著（P＜0.05）。

2.3 不同冷凍方法對阿旺綿羊胚胎移植的影響

對阿旺綿羊的胚胎做不同冷凍處理，將部分冷凍胚胎解凍并復蘇后移植入受體澳湖母羊體內(nèi)，結(jié)果顯示（表5），程序化冷凍胚移植組受體的妊娠率為35.48%，顯著高于玻璃化冷凍胚移植組受體的妊娠率為13.63%（P＜0.05）。程序化冷凍組的胚胎成羔率（26.96%）也顯著高于玻璃化冷凍組（12.00%）（P＜0.05）。阿旺綿羊兩種方法凍胚移植104枚胚胎，共移植84只受體，B超結(jié)果顯示25只受體母羊妊娠，妊娠率為 ?29.76%，產(chǎn)羔27只，胚胎成羔率為25.96%，新生羔羊狀態(tài)較好（圖3）。[FL）]

3 討論與結(jié)論

3.1 發(fā)情期內(nèi)不同月份對阿旺綿羊超排的影響

根據(jù)對阿旺綿羊繁殖性能，以及氣候和溫度等環(huán)境條件，阿旺綿羊自然發(fā)情時間普遍集中于7月-10月。為探究阿旺綿羊繁殖季不同月份對超排效果的影響，在7月與10月對阿旺綿羊超排處理后，7月組平均可用胚數(shù)（3.95±4.23）顯著低于10月組（5.45±4.03），結(jié)果差異顯著（P＜0.05）。其他結(jié)果雖無顯著性差異，但整體超排效果10月份更優(yōu)。

本試驗結(jié)果與多位研究者結(jié)果一致，如呂禮良等［7］在繁殖季對薩福克綿羊超排處理后，9月末-10月中旬均回收胚數(shù)、均可用胚數(shù)和回收率較7月末-8月中旬、8月中旬-9月初的超排效果更好。李福俊等［8］在對綿羊超排處理后，9-10月綿羊超排效果最好。奧旭東等［9］對杜泊克綿羊全年不同月份進行超排后移植，發(fā)現(xiàn)10-12月超排后均回收胚數(shù)及均可用胚數(shù)顯著高于4-6月份超排效果（P＜0.05），且受體1月、3月、6月、12月的妊娠率顯著高于其他月份（P＜0.05）。大量研究結(jié)果均表明不同月份對綿羊超排效果具有一定的影響，發(fā)情早晚對其超排處理后卵巢卵泡均可發(fā)育，但在普遍發(fā)情期間成年母羊的卵巢更活動頻繁，對FSH激素反應(yīng)敏感，卵巢卵泡發(fā)育較好、數(shù)量多，超排后可用胚數(shù)量多。

3.2 不同胚胎發(fā)育階段及移植胚胎數(shù)對移植效果的影響

受體接受移植胚胎的數(shù)量影響妊娠的成功率及胚胎存活率。本試驗關(guān)于鮮胚移植階段及數(shù)量的研究結(jié)果（表3和表4），移植2枚桑椹胚的受體妊娠率與產(chǎn)羔受體占移植受體比率較高，均達到了81.81%，同時其產(chǎn)羔率也相對較高，達到 ?57.58%，與其他組數(shù)據(jù)有顯著性差異（P＜0.05）。

本試驗結(jié)果與大多數(shù)研究報道一致，移植雙胚妊娠率及胚胎存活率高于移植單胚，且移植桑椹胚效果優(yōu)于囊胚。同時移植2枚或3枚胚胎時，受體妊娠率和產(chǎn)羔率較移植1枚胚胎顯著提高［10-11］。也有學者證實，當受體移植胚數(shù)增加至3枚以上，其受體妊娠率有所增加但差異不顯著，且降低了胚胎利用率［12-14］。羅生金等［15］對薩福克綿羊6 d鮮胚進行移植后，移植囊胚的妊娠率低于移植桑椹胚的受體妊娠率，差異不顯著。肖婷［16］對薩福克綿羊6.5 d鮮胚進行移植數(shù)量及胚胎階段進行探究，結(jié)果顯示移植2枚胚胎的產(chǎn)羔率高于移植1枚胚胎。黃承俊等［17］研究顯示移植2或3枚胚胎的妊娠率（57.89%、59.43%）高于移植1枚胚胎的妊娠率（53.33%）。研究表明，移植雙胚的妊娠成功率和胚胎存活率可以比移單枚胚胎提高10%～15%［18］。本試驗對受體母羊移植雙胚，不僅提高胚胎成羔率，同時也減少同批次移植受體的數(shù)量，提高受體母羊利用率。

3.3 不同胚胎冷凍方法對阿旺綿羊胚胎移植的影響

本研究結(jié)果顯示，程序化冷凍胚組受體妊娠率35.48%，顯著高于玻璃化冷凍胚組受體妊娠率13.63%（P＜0.05）。程序化冷凍組受體妊娠率顯著高于玻璃化冷凍胚組（P＜0.05）。程序化冷凍組胚胎成羔率也顯著高于玻璃化冷凍組。本次冷凍胚胎移植效率略低于國內(nèi)正常凍胚移植效率，解凍步驟中可能由于熱應(yīng)激引起透明帶破裂，降低凍胚移植效率［19］。王麗娟［20］對綿羊胚胎玻璃化冷凍移植，受體妊娠率為47.36%。付靜濤等［21］對綿羊冷凍胚胎移植，其妊娠率在40%～45%。吐爾洪·阿木提等［22］使用玻璃化胚胎冷凍法凍存黑頭薩福克綿羊胚胎，凍胚移植受胎率54.2%顯著高于常規(guī)胚胎冷凍法的凍胚移植受胎率44.0%。影響冷凍胚胎移植效果的因素較多，如供體品種原因、胚胎質(zhì)量和數(shù)量、受體年齡、受體生理狀態(tài)或卵巢黃體發(fā)育情況、受體同期化效果、季節(jié)、操作者的熟練度、冷凍保護劑或復蘇液、移植冷凍胚數(shù)量和質(zhì)量等［23］。

本試驗對阿旺綿羊采集胚胎進行全部凍存，為避免胚胎的浪費，未嚴格進行胚胎質(zhì)量的篩選及鑒定，可能導致胚胎冷凍后復蘇效率低，受體妊娠及產(chǎn)羔率也較低。本試驗在西藏高海拔地區(qū)進行，對受體的狀態(tài)及后期營養(yǎng)狀況要求應(yīng)較低海拔地區(qū)更嚴格。海拔高、冬季氣溫低，受體移植胚胎后應(yīng)注意氣溫變化，避免環(huán)境低溫使胚胎著床失敗導致受體妊娠率低［23］。分析本試驗結(jié)果差異性較大，聯(lián)系實際生產(chǎn)及胚胎冷凍相關(guān)文獻報道，需再進行阿旺綿羊胚胎冷凍效果的探究。

3.4 結(jié)論

西藏阿旺綿羊普遍發(fā)情時（10月）超排效果更好，其胚胎可利用率更高；受體母羊同時移植2枚阿旺綿羊胚胎，其妊娠率及產(chǎn)羔率更高；程序化冷凍胚組受體妊娠率及產(chǎn)羔率優(yōu)于玻璃化冷凍組。因此，對西藏地區(qū)阿旺綿羊進行胚胎移植技術(shù)推廣工作可行性極高，本試驗阿旺綿羊鮮胚移植98枚胚胎，共移植54只受體，B超監(jiān)測39只受體母羊妊娠，其妊娠率達72.22%，產(chǎn)羔53只，胚胎成羔率達54.08%。

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Effects of Different Factors on Freezing and Transplantation of Awang Sheep Embryos

Abstract To explore the feasibility of embryo transfer and embryo freezing in Xizang Awang sheep.Awang sheep is used as donor and Aohu sheep as acceptor to study? effect of different months of estrus on the superovulation in Awang sheep， the effect of fresh embryos at different developmental stages and the number of transferred embryos on the conception rate together with lambing rate of Awang sheep， as well as the effect of freezing methods on embryo transfer.The results showed that the number of embryos available in the superovulation group in July in estrus （3.95±4.23） is evidently lower than that in the superovulation group in October （5.45±4.03）.The pregnancy rate of two morulae transferred from Awang sheep is the highest at 81.81%， and the lambing rate is 57.58%.The pregnancy rate of Awang sheep embryos in programmed freezing group is 35.48%， while the vitrification group is 13.63%.Therefore， Awang sheep embryo transfer technology is feasible in Xizang.

Key words Awang sheep; Developmental stage; Vitrification; Programmed freezing