甘肅玉米灰斑病病原鑒定及遺傳多樣性分析

戴子淙 高建昊 張小杰 洪流 王春明 周天旺 陳杰新 郭成

摘 要 為掌握甘肅地區玉米灰斑病的發生分布、病原種類及遺傳多樣性，于2021-2022年調查了該病害在甘肅的分布范圍，對采集的灰斑病樣品進行分離與鑒定，并采用ISSR分子標記技術對甘肅玉米灰斑病菌的遺傳多樣性進行分析。結果表明，玉米灰斑病在甘肅隴南和隴東大部分地區均有發生，并已擴展至隴中地區；經形態學和分子生物學鑒定甘肅地區玉米灰斑病病原菌為玉米尾孢（Cercospora zeina）；16條ISSR引物共擴增出74條條帶，多態性條帶73條，比例為98.65%。甘肅省隴南地區種群遺傳多樣性最為豐富，且與陜西省的遺傳距離最?。?.021 4）、遺傳相似度最高（0.978 9），隴東地區次之。在遺傳相似系數為? 0.63時，可以將所有菌株分為4個亞群，亞群1中有28個菌株，其中包括16株隴南地區菌株、5株隴東地區菌株和7株來自陜西地區的菌株；亞群2中只有1個隴南地區菌株；亞群3中有10個菌株，包括隴南地區4個、隴東地區1個和5個陜西菌株；亞群4有2個菌株，隴東地區和陜西菌株各1個，4大類群分別包含來自不同地域的菌株。以上結果說明，同隴東地區相比，隴南地區與陜西地區的菌株遺傳相似度更高，且亞群內遺傳多樣性與地理來源之間無明顯的相關性。

關鍵詞 甘肅；玉米灰斑病；分布；玉米尾孢；遺傳多樣性

玉米（Zea mays L.）是中國種植面積最大、總產量最高的糧食作物，還是優良的飼料作物和化工原料，在國民經濟中占據主導地位［1］。玉米灰斑病是由尾孢屬真菌引起的一種世界性玉米病害［2］，主要危害植株葉片，同時也侵染玉米苞葉和葉鞘［3］。嚴重時病斑匯合連片使葉片枯死，從而影響玉米灌漿，造成籽粒干癟、千粒質量下降。通常會造成玉米產量損失10%～30%，嚴重時可達60%以上，甚至造成絕收［4］。由于全球氣候變化異常，栽培措施不斷變革，玉米品種引種頻繁，如今該病害成為中國近年來上升很快、為害較嚴重的病害之一［5］，已在全國至少17?。ㄗ灾螀^、直轄市）87個地市（自治州）發生［6］，嚴重威脅中國玉米的產量和質量。

目前，全球已知玉米灰斑病的致病菌有4種：玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae-maydis）、玉米尾孢（C.zeina）、高粱尾孢玉米變種（C. sorghi var. maydis），還有1個未確定種（Cercospora sp.）［7-8］。中國玉米灰斑病的致病菌主要有玉米尾孢和玉蜀黍尾孢，二者在形態上極為相似，在侵襲力和毒力方面未表現出顯著不同，但在生長特性、生態適應性和分子特征方面存在差異［9］。北方以玉蜀黍尾孢菌為主，南方則以玉米尾孢菌為主。玉蜀黍尾孢灰斑病最早于1991年在中國遼寧發現［3］，之后迅速蔓延到吉林、黑龍江［10］以及內蒙古自治區，目前已擴展至山西、山東、北京、天津、安徽等9個?。?］。玉米尾孢菌則最早于2001年出現在中國云南地區［9］，2003年在云南西南部爆發，很快成為云南高海拔山區的玉米主要病害，在季風、氣候等因素影響下逐年向北擴散至貴州、重慶、四川等地，并迅速取代玉蜀黍尾孢成為西南地區灰斑病的主要致病菌［11］，并有向北方玉米區擴展的態勢。已有報道在河北、河南、陜西、四川、湖南和湖北等地均檢出兩種玉米灰斑病病原［9，12］。

甘肅省是中國北方春播玉米的主產區之一［13］，玉米種植區域主要集中在河西走廊、隴東地區、甘肅中部及隴南山地［14］。近幾年甘肅省農業科學院植物保護研究所玉米與雜糧作物病害研究室

對甘肅玉米灰斑病發生重點區域及周邊地區進行監測，發現該病害已經由隴東、隴南地區擴展至甘肅中部，且有擴散趨勢。目前中國對于玉米灰斑病病原學和發生流行規律的研究與報道有很多，但尚未見有關甘肅地區玉米灰斑病的系統性研究。因此，摸清甘肅地區玉米灰斑病的發生分布、病原種類及種群的遺傳變異情況，以便進一步監測預警該病害的發生流行，同時為該病害的綜合治理提供技術支撐，這對保障甘肅乃至西北地區玉米產業的綠色發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病害調查和樣品采集

甘肅省農業科學院植物保護研究所玉米與雜糧作物病害研究室

于2021-2022年對甘肅省隴南、隴東和中部地區進行調查并采集樣品，玉米灰斑病調查參照中華人民共和國農業行業標準，NY/T1248.11-2016“玉米抗病蟲性鑒定技術規范-第11部分：灰斑病”［15］。調查地點涉及甘肅7個市46個縣鎮，共采集樣品60份。

1.2 供試材料

供試培養基：水瓊脂培養基（WA）成分為瓊脂15 g、水1 L；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）成分為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水? 1 L；玉米葉粉碳酸鈣瓊脂培養基（MLPCA）成分為玉米葉粉15 g、CaCO3 3 g、瓊脂15 g、水1? L［16］。

試劑及儀器：2×Power Taq PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker均購自近岸蛋白質科技有限公司；TBE購自北京索萊寶科技有限公司；真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒（B518229-0100）購自上海生工生物工程股份有限公司；PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 病原菌的分離純化

參考譚世麒［5］的方法進行分離。病健交界處剪取5 mm×5 mm左右組織塊，無菌水沖洗表面，使用75%酒精浸洗約30 s，無菌水漂洗3次。將處理好的葉片平鋪在疊有濕潤濾紙的WA上，25 ℃培養5～10 d。待生長出菌絲后挑取至PDA上培養。單孢純化采用方中達［17］的方法并加以改進。將分離物在PDA上25 ℃恒溫黑暗培養15～20 d后，刮取菌絲于試管內，加入3～5 mL的無菌水震蕩，制成孢子懸浮液均勻涂布至WA上（每10 μL孢子懸浮液在10倍鏡下觀察每個視野有1～2個孢子即可）。利用體式顯微鏡挑取單個孢子至PDA培養基，25 ℃培養5～10 d，即可獲得純化菌株。

1.4 形態學鑒定

參考劉可杰等［18］的方法，將純化菌株轉接于PDA和MLPCA上培養。PDA培養基置于? 25 ℃黑暗培養30 d，觀察并記錄菌落的形態特征、生長直徑等狀況；MLPCA培養基置于25 ℃培養箱中黑暗培養5～7 d。利用接種針輕刮菌落表面制成簡易玻片，觀察菌絲及分生孢子梗的形態特征，測量40～50個分生孢子大小，求取平? 均值。

1.5 分子生物學鑒定

純化菌株在PDA上培養30 d左右刮取菌絲，待干燥后裝入無菌離心管，經液氮充分冷凍后研磨成粉末，用真菌基因組DNA快速抽取試劑盒提取菌株DNA。將玉米灰斑病致病菌H3組蛋白通用引物CylH3F和CyIH3R作為尾孢菌陽性對照對供試菌株進行PCR擴增，通過產物的片段大小判斷是否為Cercospora。采用C.zeae-maydis、C.zeina、未知種Cercospora sp.的特異性引物組合CzeaeHIST/CyIH3R、CzeinaHIST/CyIH3R、CmaizeHIST/CyIH3R對全部菌株進行尾孢菌種的特異性檢測，明確病原種類。在此基礎上，采用對尾孢屬不同種具有多態性擴增的引物CZM2F/CZM2R進一步鑒別C.zeae-maydis、C.zeina和C. sorghi var. maydis（高粱尾孢玉米變種），引物序列見表1。參考趙立萍［19］的PCR反應體系：DNA模板2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 補足25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環，72 ℃最終延伸? 10 min。取5.0 μL PCR產物在1.0 %的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，檢驗基因擴增結果。

將PCR產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行H3組蛋白基因測序，測序結果在NCBI網站上進行比對，并從GenBank數據庫下載同源性較高的H3組蛋白基因序列，利用MEGA7.0軟件采用鄰近相接法構建系統發育樹（Bootstrap=1 000）。

1.6 ISSR遺傳多樣性分析

參考張小飛等［20］、趙立萍［19］和陳思文［21］篩選的多態性豐富的16條ISSR引物（表2），對28株甘肅菌株進行ISSR擴增，并選擇13株陜西菌株作為參照（表3）。ISSR反應體系同“1.5”節，反應程序參考趙立萍ISSR-PCR擴增所用程序。取5.0 μL PCR產物在1.0 %的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，用凝膠成像系統拍照并用Excel 2019統計條帶數（同一位置有條帶記為1，無條帶記為0）。利用Popgen 32軟件和NTSYS-pc2.10 version軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 玉米灰斑病分布地域

2021-2022年對甘肅省隴南、隴東、中部地區共計46個鄉鎮進行實地調查，發現玉米灰斑病在隴南市成縣、康縣、徽縣和兩當縣發生嚴重，其中徽縣的柳林鎮、銀杏樹鎮和栗川鎮部分田塊灰斑病病株率達到100%，病級3～5級；徽縣伏家鎮病株率100%，病級為1～3級；成縣紅川鎮、拋沙鎮病株率達到100%，病級5～7級；兩當縣城關鎮、金洞鄉病株率分別為100%和50%，病級均為1～3級，屬偏重發生。天水市的秦州區、秦安縣、麥積區和隴南市的禮縣、西和縣灰斑病的平均病株率為8.2%～16.7%，屬中度發生。平涼市的涇川縣、崇信縣、華亭縣、崆峒區；慶陽市的合水縣、環縣、鎮原縣、西峰區；隴南市的武都區和宕昌縣灰斑病的平均病株率小于5%，屬輕度發生。甘肅中部蘭州市榆中縣、白銀市會寧縣和定西市安定區該病害零星發生。病害分布區域見圖1。

2.2 形態學鑒定結果

病菌在PDA培養基上生長緩慢，菌落致密，近圓形，邊緣呈平滑或不規則狀，菌落正面灰白至灰黑色，背面鐵灰色，偶有十字狀開裂，1～2周后菌落表面萌發出白色絮狀菌絲，培養20 d菌落直徑為7～14? mm，生長速率為0.5～0.65 mm/d。光學顯微鏡下觀察，分離菌株的分生孢子梗呈淡橄欖色或棕褐色，有1～5個隔膜，一般3～14根簇生，直或膝狀彎曲；分生孢子單生，呈半透明狀，為倒棍棒狀或紡錘形，薄壁，光滑，頂端微鈍，有? 1～10個隔膜，大小在（42.4～100.5）μm×? （4.5～10.8）μm，平均為65.6 μm×7.6 μm。同趙立萍等［9］、劉慶奎等［10］報道的形態學特征一致。形態學鑒定表明，分離菌株均為玉米尾孢（C.zeina）。菌落及孢子形態見圖2。

2.3 分子生物學鑒定結果

利用H3組蛋白通用引物CylH3F和CyIH3R作為尾孢屬真菌陽性對照對供試菌株進行PCR擴增，擴增出目的片段大小均為389 bp（圖3），可初步確定供試菌株均為Cercospora。采用4對特異性引物進行PCR擴增，僅C.zeina的特異組合CzeinaHIST和CyIH3R擴增出284 bp的目標片段，C.zeae-maydis和未知種Cercospora sp.的特異引物組合并未擴增出條帶。以CZM2F和CZM2R的引物組合擴增僅獲得310 bp的C.zeina特征條帶（圖4），未擴增出代表C.zeae-maydis（760 bp）和C.sorghi var.maydis? （1 020 bp）的條帶。

將PCR產物測序結果上傳至NCBI基因庫進行比對，結果表明：28株菌株同玉米尾孢（C.zeina）序列同源性最高。利用MEGA7.0軟件以玉米大斑凸臍孺孢菌（Exserohilum turcicum）為外類群，玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae-maydis）為內類群構建系統發育樹（Bootstrap=1 000），結果顯示供試的28株菌株均能與玉米尾孢（C.zeina）聚為一支（圖5）。通過對兩種鑒定結果進行分析比較認為，分子鑒定結果與形態學鑒定結果一致，此次分離出的28株菌株均為玉米尾孢? （C.zeina）。

2.4 ISSR遺傳多樣性分析

對供試的41株玉米灰斑病菌（甘肅28株，陜西13株）進行ISSR擴增，結果表明：擴增條帶的分子堿基數為100～2 000 bp（圖6），16條ISSR引物共擴增出74條條帶，平均每條引物擴增出4.63條條帶，其中多態性的條帶數為73條，多態性條帶比例為98.65%，不同引物擴增出的遺傳圖譜差異較大，同一引物下不同菌株的條帶相似但不完全一致，這表明玉米灰斑病菌群體有豐富的遺傳多樣性。將建立的0、1矩陣，利用Popgen軟件分析，結果顯示（表4），Neis基因多樣性指數和Shannon信息指數均以隴南地區為最高，分別為0.311 5和0.464 9，該地區菌株的基因豐富度最高；陜西省次之，分別為0.294 3和0.448 0，隴東地區分別為0.265 3和0.397 0；3個地區的有效等位基因數在1.452 1～1.541 5，平均有效等位基因數為1.493 6；多態位點百分率在? 74.32～91.89，平均為85.58；多態位點數在55～68，平均為63.33。隴南地區有效等位基因數、Neis基因多樣性指數、Shannon信息指數、多態性位點數和多態位點百分率最高，表明隴南地區菌株遺傳多樣性最為豐富。

如表5所示，甘肅2個地區中隴南地區與陜西省的遺傳距離最小（為0.021 4），遺傳相似度最高（為0.978 9）；隴東地區與陜西省的遺傳距離最遠（為0.048 7），遺傳相似度最低（為0.952 4）；而隴東地區與隴南地區的遺傳距離為0.037 3，遺傳相似度為0.963 3，介于二者之間；表明這3個地區間病原菌的遺傳相關性較高且不同地區種群間的遺傳分化程度有差異，甘肅隴南地區與陜西省玉米灰斑病病原之間遺傳距離小，親緣關系更近。

利用NTSYS-pc version 2.10軟件對供試的41個菌株進行聚類分析。結果顯示（圖7），供試菌株間的相似系數為0.59～0.92，不同菌株間相似程度有顯著差異。遺傳相似系數為0.63時，可以將所有菌株分為4個亞群，亞群1中有28個菌株，其中包括16株隴南地區菌株、5株隴東地區菌株和7株來自陜西地區的菌株；亞群2中只有1個隴南地區菌株；亞群3中有10個菌株，包括隴南地區4個、隴東地區1個和5個陜西菌株；亞群4有2個菌株，隴東地區和陜西菌株各1個。4大類群分別包含來自不同地域的菌株，結果說明亞群內遺傳多樣性與地理來源之間無明顯相關性。

3 結論與討論

為明確近期玉米灰斑病在甘肅省的發病情況，甘肅省農業科學院植物保護研究所玉米與雜糧作物病害研究室于2021-2022年對甘肅省玉米種植區進行調查，結果顯示甘肅7個市（州）46個鄉鎮玉米灰斑病均有發生和危害，其中隴南市的徽縣、成縣和康縣等部分地區發病最重，天水市、平涼市及慶陽市發病較輕，甘肅中部的蘭州市榆中縣、白銀市會寧縣和定西市安定區也有零星發生。對比郭成等［22］2015年僅在甘肅隴南地區發現玉米灰斑病的結果，該病害已擴展至甘肅隴東地區和隴中地區，發病地區數量呈明顯增加趨勢。如今玉米灰斑病已成為甘肅玉米生產的潛在危害之一，應警惕該病害進一步向甘肅其他地區繼續擴散的可能。

本試驗對甘肅玉米灰斑病標樣進行分離，經形態學和分子生物學方法將其病原菌確定為玉米尾孢（C. zeina）。與玉蜀黍尾孢相比較，玉米尾孢具有更強的致病力，且與寄主的適合度更高［19］。高海拔高濕度的環境條件更加適宜尾孢灰斑病的發生和流行［23］。目前由玉米尾孢菌引起高度感染的地區，如云南海拔1? 200～2 100 m的山區，四川省海拔1 000 m以上的地區等，均位于海拔較高的玉米種植區。甘肅省海拔1 500～? 3 000 m，且隴南地處秦巴山地，雨量豐沛、氣候冷涼濕潤，適宜尾孢灰斑病生存，這與該地區發病較重的調查結果相一致。作為一種氣傳病害，玉米灰斑病的病原可隨氣流遠距離傳播。有研究表明尾孢菌正以云南為中心沿著貴州、四川、湖南、湖北、陜西和河南一線向中國黃淮海夏玉米區及北方春玉米區擴散［6］。但甘肅省農業科學院植物保護研究所玉米與雜糧作物病害研究室在與甘肅接壤的四川省廣元市一帶并未調查到該病害的發生分布，同時甘肅與四川省接壤的隴南市文縣該病害僅為零星發生，而同陜西省相接的隴南市康縣、成縣、兩當縣等地發病較重，因此推斷病原菌可能借助由太平洋暖濕氣流帶來的東南向西北的水汽輸送從陜西傳至甘肅。為進一步探究陜西與甘肅病原之間的潛在聯系，本研究對甘肅省隴南、隴東及陜西省的玉米灰斑病菌株進行ISSR遺傳多樣性分析，結果顯示多態性條帶比例為98.65%，這表明玉米灰斑病菌群體有豐富的遺傳多樣性。這與張小飛等［12］、任智惠等［24］研究得出玉米灰斑病菌菌株間具有豐富的遺傳多樣性的結論一致。Popgen分析結果顯示Neis基因多樣性指數在? 0.265 3～0.311 5，Shannon信息指數在0.397 0～ 0.464 9，表明甘肅玉米尾孢菌種群存在較高的遺傳變異，這與趙立萍［19］研究發現玉米尾孢種群存在較高的遺傳變異這一結論相一致，但與劉慶奎［23］研究認為在玉米灰斑病菌中存在的遺傳變異不高的結論不一致。這可能是各地不同地區的病原菌受氣候、人工作業等諸多因素對遺傳變異的影響表現出差異導致的。其中隴南地區和陜西省的遺傳相似度高達0.978 9，隴東地區和陜西省的遺傳相似度高達0.952 4，說明甘肅省玉米灰斑病菌與陜西省玉米灰斑病菌的親緣關系較近，這與趙立萍［19］、Duan等［25］關于陜西和甘肅玉米灰斑病菌種群遺傳相似度高的結論一致，說明這兩個地理種群之間存在密切的遺傳交流。當遺傳相似系數為0.63時，可以將所有菌株分為4個亞群，4個亞群分別包含來自不同地域的菌株，結果說明亞群內遺傳多樣性與地理來源之間無明顯的相關性，這與張小飛等［20］、任智惠等［24］研究結論一致。玉米尾孢菌從陜西西部與甘肅接壤的漢中、寶雞、咸陽一帶隨風雨進入隴南及隴東地區，并逐年向中部擴展。因此，需警惕未來數年該病害有可能通過甘肅隴東地區進入寧夏南部和陜西北部等地，以防對玉米生產造成威脅。

本研究初步明確了玉米灰斑病在甘肅省的地域分布、病原種類以及病原菌遺傳多樣性，仍需開展病害監測預警和發生規律等方面的相關研究，旨在為該病害的綜合防控提供技術支撐。

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Identification and Genetic Diversity Analysis of Pathogen of Maize Gray Leaf Spot in Gansu

Abstract In order to understand the occurrence and distribution of maize gray leaf spot and its pathogen species and genetic diversity? in Gansu Province，the distribution range of the disease in Gansu Province was investigated during 2021 to 2022. The? samples of gray leaf spot were isolated and identified，and the genetic diversity of the pathogen was analyzed by ISSR molecular marker technology. The results showed that the gray leaf spot occurred in most areas of eastern and southern Gansu，and? extended to central Gansu. The pathogen of gray leaf spot was identified as Cercospora zeina by morphology and molecular biology. A total of 74 bands were amplified by 16 ISSR primers，with 73 polymorphic bands，accounting for 98.65%. The genetic diversity of Longnan population was the most?? abundant，and the minimum genetic distance from Shaanxi Province was 0.021 4，and the highest genetic similarity was 0.978 9，followed by Longdong region. When the genetic similarity coefficient was?? 0.63，all strains could be divided into four subgroups. There were 28 strains in subgroup 1，including 16 strains from Longnan，five strains from East Gansu and seven strains from Shaanxi. There was only one strain from Longnan in subgroup 2. There were 10 strains in subgroup 3，including four strains from Longnan，one strain from East Gansu and five strain from Shaanxi. There were two strains in subgroup 4，one strain from Shaanxi， and one strain from Longdong. The four groups contained strains from different regions. The above results showed that compared with East Gansu area，the genetic similarity of strains from Longnan and Shaanxi was higher，and there was no significant correlation between genetic diversity and geographical origin.

Key words Gansu Province; Gray leaf spot; Distribution; Cercospora zeina; Genetic diversity