肺部結(jié)節(jié)或腫塊患者肺泡灌洗液SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化在肺癌診斷中的價值

朱東平 ，李海峰 ，馮俊飛 ，湯秋恒 ，冷 靜

（1）大理大學臨床醫(yī)學院，云南 大理 671003;2）云南省第三人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，云南 昆明 650011）

目前，肺癌已成為我國發(fā)病率、死亡率最高的腫瘤之一。我國健康體檢者每年通過影像檢查出肺部結(jié)節(jié)檢出率約為31%，良性結(jié)節(jié)約占96.4%，6 mm 以上肺結(jié)節(jié)惡性程度明顯增大風險超過1%[1]。早期惡性肺部結(jié)節(jié)診斷的檢出率極低，僅為腫瘤結(jié)節(jié)的2%。DNA 甲基化是表觀遺傳學領(lǐng)域中的1 個關(guān)鍵研究方向，它在原位肺部惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色[2]。隨著實時熒光PCR（real-time PCR，RT-PCR）技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化與肺癌密切相關(guān)[3-4]。

本研究通過RT-PCR 對支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化單獨與聯(lián)合對肺部結(jié)節(jié)或腫塊性質(zhì)進行檢測，以確定其診斷效能，為影像學和細胞學診斷不明時，提高肺癌的檢出率，便于肺部良惡性疾病鑒別診斷及輔助肺癌早期診斷。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究對象均來自云南省第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院患者，該方案通過了云南省第三人民醫(yī)院倫理委員會審查（2024KY001），在研究過程中詳細告知患者研究細則，并簽署知情同意書。收集2019 年3 月至2020 年3 月經(jīng)云南省第三人民醫(yī)院胸部影像學發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)、腫塊的患者99 例。納入標準：（1）胸部CT 提示肺部結(jié)節(jié)、腫塊患者根據(jù)《中國肺部結(jié)節(jié)分類、診斷和治療指南2016 版》診斷[5]，經(jīng)臨床排外感染病灶者；（2）年齡14～80 歲患者；排除標準：（1）不適宜進行纖維支氣管鏡檢查者；（2）已明確診斷肺癌和肺部炎癥患者；（3）病情垂危者及失訪者。并在1a 內(nèi)進行定期隨訪、肺活檢及手術(shù)后病檢，50 例患者最后確診為原發(fā)性肺癌，病理類型為腺癌23 例、鱗癌14 例、腺鱗癌2 例、小細胞癌1 例、大細胞癌1 例、其它肺部惡性腫瘤9 例。

1.2 BALF 提取

對99 例患者進行纖維支氣管鏡檢查，操作均由云南省第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科副主任及以上醫(yī)師取樣，參照2013 年英國胸科學會成人纖維支氣管鏡檢查標準[6]，分3 次將滅菌生理鹽水20 mL注入病變肺段，共60 mL，負壓抽吸前停留20 s，回收量不少于30 mL，取20 mL 離心，10 000 r/min離心5 min。記錄回收的BALF 總量，然后進行刷檢，采集組織標本。

1.3 BALF 中SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化檢測

1.3.1 DNA 提取將提取的20 mL 肺泡灌洗液進行離心，10 000 r/min 離心5 min，經(jīng)過沉淀后，使用移液槍去除上清液后提取肺泡細胞，然后將肺泡細胞中DNA 提取出來。

1.3.2 DNA 甲基化的PCR 檢測SHOX2 和RASSF1A 基因檢測試劑盒、引物和探針均由上海透景生命科技股份有限公司提供。本研究采用亞硫酸鹽修飾和Real-time PCR（Taqman 探針法）2種方法處理離心后提取的DNA。首先，亞硫酸鹽修飾：利用亞硫酸鹽將未甲基化堿基替換后進行PCR 擴增。通過觀察免疫熒光染色，可以區(qū)分甲基化和未甲基化的C 堿基。Taqman 探針法：通過采用Taqman 探針檢測擴增產(chǎn)物，在實時PCR平臺上實現(xiàn)對肺泡組織中甲基化DNA 的特異性檢測，最后使用通用實時熒光PCR 儀循環(huán)階段收集FAM、VIC 及 CY5 的信號。FAM 用于檢測RASSF-1A 基因甲基化狀態(tài)，VIC 用于檢測SHOX2 基因的DNA 甲基化狀態(tài)，CY5 用于檢測內(nèi)標基因βactin 的水平，（VIC 通道 Ct <32 為陽性；FAM 通道 Ct <35 為陽性；CY5 通道18≤ Ct ≤23 提示內(nèi)參有效，若超出需計算△Ct 值）。

1.4 組織病理學檢測

1.4.1 經(jīng)皮肺活檢應用320 排螺旋CT 掃描，確定穿刺點后利用2%利多卡因針局部浸潤麻醉，應用11.8 cm 的穿刺針分布進針方法一次穿刺至胸膜、靶病變邊緣及病變內(nèi)，4%甲醛固定后進行組織病理及細胞學檢測。

1.4.2 手術(shù)切除病檢經(jīng)螺旋CT 診斷結(jié)節(jié)、腫塊部位，經(jīng)手術(shù)切除后進行相應染色處理，行組織病理及細胞學檢測，由該機構(gòu)資深病檢學家出具診斷報告。

1.5 統(tǒng)計學處理

使用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量（表示為平均值±標準差），使用兩獨立樣本t檢驗比較；采用χ2分析臨床病理結(jié)果中SHOX2、RASSF1A 甲基化的陽性率；應用ROC 曲線評價SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化對肺癌診斷的效力，并獲得最佳約登指數(shù)（靈敏度+特異度-1），P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病例特征分析

共納入99 例患者，其中病理檢測明確診斷為肺癌患者50 例，良性疾病組49 例，99 例患者的平均年齡為61.79 歲，其中肺癌組平均年齡（62.64±9.71）歲，較良性疾病組年齡（60.48±13.69）歲大，2 組年齡差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.032），吸煙史增加患肺部惡性腫瘤風險（P<0.001）。性別、胸部CT 提示結(jié)節(jié)大小均無統(tǒng)計學意義（P=0.132，P=0.177 和P=0.065），見表1。

表1 臨床病例特征[（n）%/（）]Tab.1 Clinical case characteristics[（n）%/（）]

*P <0.05。

2.2 2 組肺泡灌洗液中SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化PCR 對比結(jié)果

在2 組SHOX2 和RASSF1A 2 基因甲基化PCR檢測中，單基因、雙基因聯(lián)合或任意基因甲基化對肺癌檢測差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），肺癌組任意基因陽性較對照組有明顯差異（χ2=54.046，P<0.001），見表2；對肺部惡性腫瘤進行分類，發(fā)現(xiàn)在2 基因甲基化PCR 任一陽性對肺腺癌、肺鱗癌檢出率均高，分別為91.3%、85.71%，見表3。

表2 2 組SHOX2 和RASSF1A 基因組甲基化PCR 檢測結(jié)果 [n（%）]Tab.2 PCR results of SHOX2 and RASSF1A genome methylation in two groups [n（%）]

表3 不同類型肺癌患者基因甲基化檢測 [n（%）]Tab.3 Gene methylation in patients with different types of lung cancer [n（%）]

2.3 研究指標多因素回歸分析

將單因素差異性分析中P<0.05 變量直接納入多因素回歸分析，將SHOX2 陰性、RASSF1A 陰性和不吸煙作為參考類別，發(fā)現(xiàn)SHOX2、RASSF1A及吸煙是肺癌診斷的獨立危險因素（P<0.05），2組年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.469）；肺泡灌洗液SHOX2 基因甲基化陽性患者比SHOX2陰性患者患癌風險增加13.675 倍（P=0.009，95%CI：2.146～20.451），RASSF1A 基因甲基化陽性患者比RASSF1A 陰性患者患癌風險增加3.644 倍（P=0.014，95%CI：1.245～8.245），此外，吸煙患者比不吸煙患者患癌風險增加，見表4。

表4 多因素Logistics 回歸分析Tab.4 Multi-factor Logistics regression analysis

2.4 2 組基因甲基化PCR 結(jié)果ROC 分析

進一步評估了2 基因甲基化檢測99 例肺部結(jié)節(jié)和腫塊患者預測價值，生成了受試者工作曲線，SHOX2 和RASSF1A 檢測肺癌曲線下面積、靈敏度和特異度，見表5、圖1。SHOX2、RASSF1A和2 基因聯(lián)合檢測曲線下面積分別為0.829、0.770 和0.869，SHOX2+RASSF1A 聯(lián)合高于單一檢測，靈敏度和特異度為0.84，0.898。

圖1 SHOX2 和RASSF1A 基因ROC 曲線Fig.1 SHOX2 and RASSF1A were detected by the ROC curve

表5 單一指標和雙指標聯(lián)合檢測結(jié)果Tab.5 Combined detection results of single index and double index

2.5 對良性疾病組中SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化陽性患者隨訪

對起始拒絕行肺穿刺活檢及手術(shù)病檢的2 例患者，每1、3、6 個月進行電話隨訪、約定隨訪復查，詢問相關(guān)肺部疾病癥狀演變，是否在外院進行相關(guān)治療，復查后經(jīng)由該院資深影像學家閱片，有1 例患者病情惡化，經(jīng)病理檢測診斷為肺癌，另1 例患者肺部結(jié)節(jié)消失，考慮為肺部炎癥。

3 討論

隨著我國的工業(yè)化和城市化不斷發(fā)展、老年基數(shù)增大及長期吸煙等危險因素影響導致我國體檢人群中肺結(jié)節(jié)檢出率為31%[1]，而歐美國家，體檢發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)的概率更高，達到了41%～51%[7]。此外，肺部長期存在磨玻璃結(jié)節(jié)的患者，最后診斷惡性腫瘤概率超過了10%。根據(jù)最新研究結(jié)果[8]顯示，肺癌在我國以及全世界已成為發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，對人類健康造成了嚴重的威脅。

據(jù)我國腫瘤登記報告顯示，云南省的肺癌發(fā)病率平均為每10 萬人中的44 例，是全國平均水平的2～3 倍。而云南宣威肺癌發(fā)病率高達93/10萬人，位居全國第一[9]，因此提升肺癌的診斷率變得迫切和必要。2011 年美國進行國家肺癌篩查實驗（national lung screening trial，NLST），采用隨機對照研究對高危肺結(jié)節(jié)患者進行低劑量胸部CT（常規(guī)CT1/5 輻射劑量）篩查，這一措施比單獨X 胸片降低了20%肺癌患者病死率[10]，因此為提高肺部腫瘤早期發(fā)現(xiàn)，我國建議高危肺結(jié)節(jié)人群每年進行低劑量胸部CT 篩查[11]。但有研究顯示[12]，通過低劑量螺旋CT（low-dosespiral computed tomography，LDCT）能檢測出患者的非鈣化結(jié)節(jié)中實際僅為腫瘤結(jié)節(jié)的2%，很大程度影響了患者早期肺癌檢出。在高肺癌發(fā)病率的云南地區(qū)，對沒有明顯呼吸道癥狀及早期結(jié)節(jié)直徑小于1 cm 的肺癌患者，由于腫瘤標記物、細胞學檢查、影像學檢查和支氣管鏡檢對肺癌檢出率相對較低，而且難以取得活體組織進行病檢，所以多數(shù)患者被診斷為惡性腫瘤時已進展到晚期，從而錯過最佳手術(shù)及放化療治療時期，致肺癌整體5 a生存率低，僅為16%左右[13]。因此對高危肺癌患者的篩查、早期診斷、及時干預治療尤為重要。

研究表明DNA 甲基化被廣泛應用于癌癥的輔助診斷，特別是在BALF 和胸腔積液等微創(chuàng)檢測中[14]。矮小同源盒基因（short stature homobox 2，SHOX2）是同源盒基因家族的一員，參與癌癥早期病變。劉瑩等[3]研究發(fā)現(xiàn)，SHOX2 基因在實體腫瘤中表達異常，如肺癌、乳腺癌和腎癌等，在肺癌組織中高表達，可能與甲基化后染色體穩(wěn)定性受損、促癌基因的表達、腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)和遺傳穩(wěn)定性失去平衡等，導致細胞增值失控。RASSF1A基因，Ras 相關(guān)區(qū)域家族蛋白1A（ras-association donmain family，RASSF1A）是1 種新型的腫瘤抑制基因，在腫瘤生長過程中起著很重要抑制作用，參與了許多靶基因的調(diào)控，如基因轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)錄、細胞骨架、細胞周期和凋亡。研究發(fā)現(xiàn)細胞癌變是由于啟動子區(qū)異常高甲基化、雜合性缺失及染色體缺失等導致了RASSF1A 基因失活[4]，從而導致腫瘤細胞增值。SHOX2 甲基化能較好的區(qū)分肺部良、惡性病變[15]。本研究通過收集肺部結(jié)節(jié)或腫塊患者肺泡灌洗液，進行SHOX2 及RASSF1A 基因甲基化PCR 檢測，通過病檢得到肺結(jié)節(jié)性質(zhì)對2 基因結(jié)果統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示SHOX2、RASSF1A 基因聯(lián)合對肺癌診斷的靈敏度為84%，特異度為89.8%，進一步進行多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)在排除吸煙及年齡影響后，2 基因甲基化陽性對早期肺癌仍有較高的診斷效能，可以作為肺癌獨立危險因素，與肺泡灌洗液細胞學檢測相比，可為臨床上提供有效補充工具，避免了患者不必要的精神、身體損害。

此外，國內(nèi)研究表明[16]，肺癌的病理類型與基因甲基化陽性檢出率有顯著相關(guān)性；此外Schmidt 等[17]對肺癌患者的血液和肺組織進行SHOX2 甲基化研究，發(fā)現(xiàn)SHOX2 基因甲基化對癌癥有很高檢出率，可以作為早期檢測指標，還可以獨立的預測非小細胞肺癌臨床預后。在本研究中，SHOX2、RASSF1A 基因甲基化在肺癌分類中發(fā)現(xiàn)肺腺癌（23 例）、肺鱗癌（14 例）、肺腺鱗癌（2）任意陽性檢出率分別為91%、86%、50%，說明在肺癌早期的肺結(jié)節(jié)、腫塊時，2 基因?qū)Ψ蜗佟Ⅶ[癌檢出敏感性極高（由于肺大、小細胞癌病例數(shù)少，僅1 例，不具有統(tǒng)計意義），對比了相關(guān)研究[18]結(jié)果，在NSCLC 中，腺癌中RASSF1A 的甲基化頻率高于鱗狀細胞癌，與本研究結(jié)果是一致的。這種現(xiàn)象可能與SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化在肺腺癌和肺鱗狀細胞癌中的高表達增高了肺惡性腫瘤的檢出。

對開始拒絕行肺穿刺活檢及手術(shù)病檢的2 例患者，在1 a 內(nèi)行電話隨訪、約定隨訪復查，復查胸部CT 后有1 例患者病情惡化，經(jīng)病理檢測診斷為肺癌；另1 例肺結(jié)節(jié)患者中，BALF 中SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化均陽性，經(jīng)治療后肺部結(jié)節(jié)吸收，考慮為肺部炎癥，該例是否因其它疾病導致基因發(fā)生了甲基化，進一步查閱大量資料對導致該現(xiàn)象進行分析并對該患者持續(xù)進行隨訪中。

本研究不足之處：（1）于周圍型肺小結(jié)節(jié)患者在留取BALF 時，有發(fā)生灌洗液中難以對結(jié)節(jié)部位進行基因標本獲取，從而導致一定假陰性結(jié)果可能性，這對操作者的支氣管鏡檢查技術(shù)帶來考驗，且在一定程度取決于患者配合程度；（2）不能短時間內(nèi)獲取全部肺結(jié)節(jié)、腫塊患者的全部臨床病理數(shù)據(jù)，導致部分失聯(lián)患者數(shù)據(jù)缺失，影響實驗結(jié)果。

綜上所述，對肺癌早期對肺部結(jié)節(jié)、腫塊性質(zhì)不能有效診斷時，SHOX2 和RASSF1A 基因甲基化可以作為有效的補充工具，提高早期肺癌的檢出，并且對肺腺癌、肺鱗癌診斷提供一定診斷依據(jù)。