CRISPR/Cas-等溫擴增技術在食源性病原菌檢測中的研究進展

張 琪，龐立冬，蘇群超，宋丹靚敏，楊鑫焱，姜毓君，張 微

（東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

食品安全是目前全世界各國都面臨的公共問題之一，長期以來持續受到各國政府及民眾的高度關注[1]。在每年報道的食品安全事件中，由食源性病原菌所引起的食物中毒事件占45%，食源性疾病的頻發不但嚴重危及人體健康，而且給社會造成了巨大的經濟損失[2]。食源性病原菌主要包括產志賀毒素大腸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等，食用這些病原菌或毒素污染的食品后會出現腹痛腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴重者則會損壞呼吸、神經系統甚至危及生命[3]。因此，實現對食源性病原菌的及時、快速檢測在保障食品安全方面至關重要。

隨著食源性病原菌檢測技術不斷發展，從最早期的傳統檢測手段開始，已發展出多種新型檢測技術。很多經典技術，如傳統微生物培養法，雖然一直被作為檢測的金標準，但培養周期長、操作繁瑣等缺點限制了其在檢測中的應用[4]。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）也是較為常用的病原菌檢測手段，在檢測時間上優于培養法，但對溫度及環境要求較為嚴格，此外還需要昂貴的儀器和專業的操作人員，難以滿足現場檢測的要求。每種方法都有不同的技術操作缺點，這些局限性限制了其在分子檢測領域的應用。而相對方便的等溫擴增技術在恒定溫度下可實現對目標DNA的快速復制與積累，該方法無需特殊的儀器、核酸擴增效率高，即使存在抑制成分也能達到優異擴增，適用于即時檢測（point of care testing，POCT），因此等溫擴增技術被視為食源性病原菌檢測的理想方法，但其應用受到非特異性擴增的阻礙，容易造成結果的不準確[5]。簇狀規則間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其關聯蛋白（CRISPRassociated protein，Cas）組成的CRISPR/Cas系統憑借自身新穎的反式切割活性進行信號放大，被稱為“下一代分子診斷技術”。然而，在沒有預擴增的情況下，CRISPR/Cas系統難以產生單個靈敏的檢測信號，這限制了其在食源性病原菌檢測中的應用[6-7]。現有檢測技術存在一定劣勢，亟待新興檢測技術的出現及應用，因此，將CRISPR/Cas系統與等溫擴增技術相結合，可以作為病原菌的快速檢測手段[8]。其原理為：首先以等溫方式對目標序列進行擴增，之后由CRISPR系統中的向導RNA識別擴增子的特定序列而產生特異性擴增檢測信號。這種聯用技術將等溫擴增的高效率與CRISPR的準確識別結合在一起，可以提高檢測的靈敏度和特異性，在實現食源性病原菌靈敏和精準現場檢測方面顯示出了巨大潛力[9-10]。

本文對CRISPR/Cas和等溫擴增技術組合的快速檢測方法進行綜述，概述CRISPR/Cas系統的分類以及該系統與等溫擴增結合后在食源性病原菌檢測方面的研究進展。進一步對納米材料和功能核酸（functional nucleic acids，FNAs）介導的信號輸出方式在CRISPR/Cas-等溫擴增組合中的應用進行相應的歸納。最后，展望并分析CRISPR/Cas-等溫擴增組合在食品安全控制應用中面臨的挑戰和未來前景，以期為該技術的推廣與應用建立一定基礎。

1 CRISPR/Cas系統及分類

CRISPR/Cas系統是存在于細菌和古細菌中的一系列防御機制，最早在大腸桿菌中被發現[11]。這種防御機制的基本原理是入侵因子如病毒、質粒等衍生的短片段被捕獲并整合到CRISPR序列位點中建立遺傳記憶，隨后將這些DNA轉錄加工成成熟的CRISPR RNA（crRNA）作為向導RNA，與Cas效應蛋白組裝后形成的復合物可以特異性識別并切割與crRNA互補的靶標序列，從而使細菌能更好地識別并防御外來入侵因子的侵害。憑借這一優勢，CRISPR/Cas系統成為一種靈活的基因編輯工具[12]。

在目前的研究中，根據Cas效應蛋白的不同可將CRISPR系統分為2 類：第1類是具有多亞基效應子的系統，每種效應蛋白在CRISPR生物傳感系統中發揮單一作用，第2類是具有單效應子的系統，每種效應子在系統中發揮多種功能[13-14]。Cas效應蛋白具體可分為6 種類型（I～VI），第1類包括I型、III型、IV型，第2類包括II型、V型和VI型[15]。目前，所應用的CRISPR/Cas系統多數基于II型的Cas9、V型的Cas12、Cas14和VI型的Cas13效應蛋白，其可高效完成靶標序列的識別和切割，已被廣泛應用于生物傳感領域[16-17]。其中V、VI型Cas效應蛋白具有反式切割活性，即效應蛋白的切割活性一經激活后可以以極高的活性切割任意序列的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA），利用這一特性CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13及CRISPR/Cas14系統已被開發成高靈敏度核酸檢測工具。根據Cas效應蛋白特性的不同，用于病原菌快速檢測的CRISPR/Cas系統可分為3 種類型：1）當靶標物質存在時，向導RNA可特異性地對靶標物質識別并結合進行檢測，此類CRISPR系統所依賴的Cas效應蛋白通常具有特異性識別并捕獲靶標的功能而不表現核酸酶切活性，如Cas9蛋白的突變體dCas9[18]；2）當靶標物質存在時，向導RNA激活Cas效應蛋白對靶標物質的切割活性，對其進行特異性識別并切割，以達到快速檢測的目的，此類Cas效應蛋白包括Cas9及其突變體Cas9nD10A；3）當靶標物質存在時，向導RNA將激活Cas效應蛋白的切割活性，引導效應蛋白對非靶標物質進行切割，這類CRISPR系統常用的效應蛋白為Cas12a、Cas13a和Cas14a。

CRISPR/Cas9系統作為第1個用于真核生物細胞基因編輯的CRISPR平臺，Cas9效應蛋白在其中充當核酸內切酶的角色，包括HNH和RuvC 2 個核酸酶結構域，由反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）和crRNA賦予其切割雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）的功能，并且tracrRNA與crRNA可連接成單一向導RNA（single guide RNA，sgRNA）[19]。在識別DNA時，目標序列下方需要有一個特定的短DNA序列片段，稱為原間隔相鄰序列（protospacer adjacent motif，PAM）。Cas9通常識別富含G的PAM，保障不會切除自身DNA，因此特性，其參與防止自身免疫疾病的機制[20]。sgRNA作為Cas9的向導RNA，與Cas9結合使其產生活性，通過HNH結構域可切割位于PAM上游3 bp處與crRNA互補的DNA鏈；通過RuvC結構域可切割位于PAM上游3～8 bp處與crRNA非互補的DNA鏈[21-22]。研究人員還通過對HNH和RuvC 2 種催化結構域進行突變形成Cas9n和dCas9 2 種蛋白突變體，其中CRISPR/Cas9n系統用于基因編輯可大幅降低脫靶活性[23]。

與Cas9相似，Cas12效應蛋白在CRISPR系統中也充當核酸內切酶的角色，近幾年逐漸成為Cas9的替代品用于基因編輯。Cas12可以識別并切割與富含T的PAM序列相鄰的靶標dsDNA，憑借這一特點在多重基因編輯方面得到廣泛應用[24]。Cas12效應蛋白包括Cas12a和Cas12b，其中Cas12a來自V-A-CRISPR系統，又稱為Cpf1，Cas12b來自V-B-CRISPR系統，又稱為C2c1。常用的Cas12a通常由單個crRNA作為向導RNA，Cas12b則需要tracrRNA和crRNA同時引導。此外，Cas12a和Cas12b的核酸結構域也有不同：Cas12a的核酸結構域為RuvC和Nuc，Nuc結構域不直接影響靶DNA，而是協助RuvC間接起作用；Cas12b的核酸結構域僅為RuvC。

Cas13效應蛋白是近幾年發現的，與Cas9和Cas12不同的是，Cas13僅可靶向識別并切割單鏈RNA（singlestranded RNA，ssRNA），由于其沒有RuvC結構域，不具備DNA酶活性，對于dsRNA、ssDNA和dsDNA無靶向識別和切割功能[25-26]。Cas13效應蛋白也分為Cas13a（被稱為C2c2）和Cas13b 2 種亞型，其中Cas13a較為常用[27]。二者在切割底物機制方面存在一些差異，Cas13a僅需要crRNA作為向導RNA，能夠在沒有tracrRNA的情況下識別含有前間隔側翼序列（protospacer flanking sequence，PFS）的位點，通過2 個結構域HEPN切割RNA，顯示其非特異性反式切割活性。目前Cas13b的作用機制尚未研究成熟，但部分研究顯示，與Cas13a相比，Cas13b在RNA編輯方面更為精確，可由成熟的crRNA輔助識別PFS位點，從而進行非特異性的RNA切割[28]。

Cas14是近幾年發現的新興效應蛋白，與其他效應蛋白相比，Cas14僅由400～700 個氨基酸組成，幾乎是其他效應蛋白體積的一半[29]。Cas14效應蛋白作為由RNA引導的DNA核酸酶，可在crRNA和tracrRNA的指導下通過RuvC識別并切割ssDNA，正是由于Cas14效應蛋白極小的體積，在切割ssDNA時不需要特定的PAM序列，對于DNA的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）的特異性更高[30]。此外，在識別靶標DNA的同時也展示了其對ssDNA的附帶切割活性，這些特征使Cas14效應蛋白在生物傳感方面展現出更大的優勢，在未來的研究中不僅可以用于基因組工程，還可用于病毒篩選及病原體檢測等相關平臺[31-32]。

2 CRISPR/Cas-等溫擴增技術檢測系統及其應用

2.1 CRISPR/Cas-等溫擴增技術檢測系統

CRISPR/Cas系統作為一種可特異性識別靶標序列并具有催化信號放大功能的檢測技術，可直接用于靶標序列的檢測。但目前的研究中仍需要對靶標序列進行擴增才能使檢測靈敏度達到要求[33]。在進行檢測時一般需要核酸提取、核酸擴增、信號生成及信號輸出4 個步驟[34]。因此，需要將CRISPR/Cas系統與核酸擴增技術相結合以提高其檢測性能。在POCT領域的應用可分為CRISPR/Cas系統的預擴增和擴增前CRISPR。圖1展示了CRISPR/Cas系統結合滾環擴增（rolling circle amplification，RCA）、重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）、重組酶輔助擴增（recombinase aidedamplification，RAA）、環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）以及鏈置換擴增（strand displacement amplification，SDA），并以納米材料和FNAs為信號輸出方式用于食源性病原菌檢測的示意圖；表1詳細概述了不同CRISPR/Cas-等溫擴增組合檢測不同病原菌時的信號輸出方式、靈敏度及線性范圍。

表1 基于不同CRISPR/Cas-等溫擴增技術組合的病原菌檢測關鍵特征Table 1 Key features of pathogen detection based on different CRISPR/Cas-isothermal amplification combinations

圖1 CRISPR/Cas-等溫擴增技術用于食源性病原菌檢測的示意圖Fig.1 Schematic diagram of CRISPR/Cas-isothermal amplification technology for foodborne pathogen detection

2.2 CRISPR/Cas系統的預擴增

為進一步提升檢測的靈敏度，檢測之前需要對核酸進行預擴增富集靶標分子，之后由向導RNA引導的特定序列特異性地產生擴增檢測信號。在近年來的研究中，CRISPR/Cas系統的預擴增已廣泛應用于食品安全檢測平臺。表2描述了常見等溫擴增系統的主要特征。

表2 常見等溫擴增系統的主要特征Table 2 Major characteristics of common isothermal amplification platforms

2.2.1 CRISPR/Cas-RCA技術檢測系統

RCA是一種高效的恒溫核酸擴增方法，其原理為核苷酸鏈退火到環狀DNA模板上，隨后引物在DNA聚合酶的作用下沿著5′至3′的方向通過環狀模板的循環擴展而延長。RCA與其他技術相比具有獨特的優勢，通過設計圓形模板序列，在適配體、DNA酶等的作用下定制所需要的RCA產物，極大拓寬了其應用范圍[55]。同時RCA技術憑借自身出色的效率、高效的選擇性及其多功能性在生物檢測和分析中得到了廣泛的應用，尤其是快速診斷和快速檢測領域。目前已有研究整合了CRISPR/Cas系統和RCA的優勢，開發了高特異性的核酸檢測平臺。

Chen Zhibao等[37]基于免疫RCA與CRISPR/Cas12a相結合設計一種超靈敏、特異性的大腸桿菌O157:H7電化學生物傳感器。在靶標大腸桿菌O157:H7引入生物傳感器之后，電化學信號發生變化。在優化條件下該生物傳感器線性范圍可達10～107CFU/mL，檢出限（limit of detection，LOD）低至10 CFU/mL，靈敏度和檢測范圍都明顯優于之前報道的方法。因此，通過將Cas12a和免疫RCA相結合可以開發出檢測病原體的新型超靈敏和特異性生物傳感器平臺，該生物傳感器對實際樣品中許多病原菌的檢測展示出了優異的性能。

2.2.2 CRISPR/Cas-RPA技術檢測系統

RPA技術于2006年被推出，是等溫擴增技術的重大突破[56]，擴增過程主要依賴于重組酶和ssDNA結合蛋白（ssDNA binding ptotein，SSB），其原理為重組酶與寡核苷酸引物結合形成復合體，并使引物與dsDNA中的同源序列相互配對，SSB與DNA鏈相結合形成穩定的D環，從引物啟動，在DNA聚合酶的作用下介導DNA擴增，最后通過重復此RPA循環實現指數擴增[57]。與其他的等溫擴增技術相比，RPA擴增速率快，通常30 min內即可完成采集樣本的全過程。因其制備要求低、操作溫度可控以及所需試劑的商業可用性等優勢，已被廣泛應用于實驗室及相關臨床環境中。

近年來研究發現，用于RPA后的檢測平臺通常需要昂貴的探針設計，靈敏度低、缺乏特異性，需要建立可以與RPA相結合的更為靈敏、特異的檢測手段。將CRISPR/Cas生物傳感系統與RPA相結合可以提高反應的特異性以及實現信號的新一輪擴增。基于此原理，將RPA作為CRISPR/Cas生物傳感系統的前預擴增技術，開發了DETECTR（DNA核酸內切酶靶向CRISPR反式報告基因）系統，該系統可用于檢測涉及癌癥和傳染病診斷的重要生物標志物[58]。目前CRISPR/Cas-RPA技術檢測系統已經廣泛應用于食源性病原菌的檢測中。Wang Pei等[59]提出將RPA與CRISPR/Cas12a和熒光分子（ssDNA-FQ）預混合在一個試管中，避免了開蓋污染，利用RPA強大的擴增能力和CRISPR/Cas12a精確的切割活化特性開發一種快速視覺檢測方法。該平臺在30 min內即可完成檢測，靈敏度達到101copies，為不同類型的核酸檢測提供了參考。除Cas12a外，基于VI型的Cas13a也被用于食源性病原菌的檢測。An Bailin等[50]將Cas13a與RPA相結合建立沙門氏菌屬檢測單管兩步反應體系。結果表明，單管RPA-Cas13a的檢測靈敏度與實時熒光定量PCR相同，達到102copies/μL；而兩步法RPA-Cas13a對沙門氏菌的LOD可達100copies/μL，更適用于低豐度樣品。該檢測平臺可在簡單的恒溫設備上進行，降低了對設備和操作人員的要求，整個過程控制在13 min內，可作為乳及乳制品中沙門氏菌的快速檢測方法，為未來的POCT應用提供思路。

2.2.3 CRISPR/Cas-RAA技術檢測系統

RAA的原理與RPA相似，依賴于從細菌或真菌中所獲得的重組酶、SSB和DNA聚合酶。在常溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結合，形成酶和引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補序列時，通過SSB的幫助打開模板DNA的雙鏈結構，并在DNA聚合酶的作用下形成新的DNA互補鏈，擴增產物以指數級增長。這一擴增過程可在30～42 ℃、30 min以內的條件下高特異性地完成[60]。唯一不同的是RPA與RAA酶的來源不同，RPA重組酶來源于T4噬菌體，而RAA重組酶來源于細菌或真菌。RAA采用的來源于細菌和真菌的DNA聚合酶和重組酶相較于RPA具有更高的活性。

CRISPR/Cas生物傳感系統已與RAA技術相結合，以檢測各種食源性病原體，包括單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌和腐敗細菌等[61]。基于CRISPR/Cas-RAA技術的檢測系統，如SHERLOCK（specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking）和DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter），已成功用于核酸檢測中，實現了多種模式下食品中病原菌的高靈敏度檢測。Zhou Chi等[38]開發了基于CRISPR/Cas12a-RAA系統的沙門氏菌定量檢測方法，原理如圖2A所示。當存在目標物質時，通過CRISPR/Cas12a的活化和切割、酶反應、葡萄糖信號讀取，實現了從靶基因到葡萄糖信號的間接轉化，該方法檢測限低至5 CFU/mL，此外在1～103CFU的范圍內實現了沙門氏菌的定量檢測。但該方法需要轉移擴增產物，增加了操作的復雜性及樣品交叉污染的風險[58]。因此Lü Xinrui等[39]設計了一種基于CRISPR/Cas12a-RAA的單管新型檢測系統用于檢測蝦樣品中的副溶血性弧菌，原理如圖2B所示。該方法在純培養物中的LOD為67 CFU/mL，在蝦樣品中的檢測限為73 CFU/mL，與之前的方法相比具有更高的靈敏度和特異性。此外，RAA所需的37 ℃的擴增條件也減少了傳統PCR擴增時極其微量的污染就可造成假陽性的結果，不到1 h即可完成整個檢測過程，不僅極大縮短了檢測時間，還可避免復雜熱循環儀的使用，滿足了副溶血性弧菌檢測的需求，為食源性病原菌的檢測提供了新思路，對食品安全監管具有重要意義。

圖2 基于CRISPR/Cas-等溫擴增技術的檢測系統Fig.2 Detection system of CRISPR/Cas-isothermal amplification technology

2.2.4 CRISPR/Cas-LAMP技術檢測系統

LAMP是2000年提出的一種核酸擴增方式，用于多種病原菌的檢測，為細菌和病毒的POCT提供了新的方向[62]。其擴增過程需要4 條特異引物，首先，內部引物結合靶標物質，在BstDNA聚合酶的作用下延伸成雙鏈，聚合酶延伸外引物以置換新合成的鏈，由于F1c和F1區域的雜交，使得位移鏈在5′端形成莖環結構，在3′端以類似的方式擴增，形成兩端具有莖環結構的DNA，靶DNA的重復序列通過連續的延伸和置換進行擴增[63]。由于LAMP技術使用4～6 個特異性引物來識別6～8 個特定區域，更具有特異性和靈敏度。反應時間基本在30 min以內，極大縮短了擴增時間。

然而，單獨使用LAMP進行擴增容易造成交叉污染，由非特異性擴增而產生假陽性結果，因此用CRISPR/Cas12a介導LAMP可消除上述缺點，實現食源性病原菌的穩定、靈敏檢測[64]。Mukama等[65]利用CRISPR/Cas12a-LAMP測得牛奶中銅綠假單胞菌的靈敏度為100CFU/mL；Kim等[66]也用該聯用手段靈敏地檢測長葉萵苣中的大腸桿菌O157:H7，靈敏度為100CFU/g。基于此原理，Lee等[40]研發了一種快速、靈敏的基于LAMP-CRISPR/Cas12a的LFB平臺，用于檢測沙門氏菌視覺化檢測。如圖2C所示，該平臺在不使用預富集培養物的情況下，對純培養物樣品的LOD為1.22×100CFU/mL。這表明該檢測平臺比常規的檢測方法具有更高的特異性和準確性，通過設計適當的目標病原體crRNA可以使該方法應用于多種類別病原菌的檢測中，使其成為一種有價值且靈敏的POCT生物傳感檢測技術。為進一步減少操作過程中的污染，Shi Yaoqiang等[41]開發了一種單管CRISPR/Cas12a增強型LAMP（CRISPR/Cas12a-E-LAMP）方法用于檢測肺炎鏈球菌。該結果可在LED藍光下實現肉眼可視化，整個過程在40 min內完成，檢測限為4×100copies/μL，在開發用于核酸檢測的下一代生物傳感器方面具有巨大潛力。

2.3 擴增前CRISPR

擴增前CRISPR 是指當靶標物質存在時，激活CRISPR/Cas效應蛋白的切割活性，再采用等溫擴增技術對其切割后的短ssDNA進行擴增以實現信號放大。由CRISPR/Cas系統觸發的指數擴增反應目前不僅有效克服了在長DNA或RNA檢測中的局限性，而且賦予了傳感平臺高靈敏度和特異性。與預擴增方法相比，擴增前CRISPR在核酸研究中可減少非特異性擴增，表現出更顯著的效率，實現在不同的病原菌中良好的選擇性，可作為檢測復雜生物樣品的高效、便捷的工具[67]。

Zhang Kaixiang等[35]開發出一種新型CRISPR/Cas9切割檢測平臺，由Cas9裂解dsDNA的切口觸發EXPAR反應來進行Cas9切割效率的評估與sgRNA的預篩選，原理如圖3A所示。使用這種新開發的擴增方法，LOD低至10 pmol/L，線性范圍為100 pmol/L～20 nmol/L，該方法可在40 min內定量Cas9的切割活性，實現高效、特異性強的CRISPR/Cas9基因組編輯。該新型生物傳感器的開發為后續食源性病原菌相關檢測方法提供了新的思路。SDA是近幾年發展起來的基于酶促反應的DNA體外擴增技術，由SDA產生豐富的ssDNA激發Cas效應蛋白的反式切割活性，避免用于靶標擴增的復雜引物設計。為進一步提高檢測效率和實際樣品分析中的性能，已有研究將SDA作為CRISPR之后的擴增手段。Sun Xuan等[36]開發出一種基于UiO9平臺的CRISPR/Cas9觸發SDA-RCA兩步等溫擴增檢測大腸桿菌O157:H7。如圖3B所示，靶毒力基因序列被CRISPR-Cas9系統識別和切割，并觸發SDA和RCA循環擴增。反應后，大量產物可以與探針雜交，并通過熒光強度定量檢測靶DNA。該方法實現了在溫和條件下特異性檢測食品基質中大腸桿菌O157:H7，最低LOD為40 CFU/mL，線性范圍為1.3×102～6.5×104CFU/mL，與傳統的RCA和SDA方法相比反應效率更高，檢測限較低，在其他病原菌檢測、食品安全檢測等方面也展現了較好的實際應用能力。

圖3 基于擴增前CRISPR的生物傳感平臺Fig.3 Biosensing platform based on pre-amplification CRISPR

3 CRISPR/Cas-等溫擴增技術檢測系統信號輸出

3.1 納米材料

納米材料在開發基于CRISPR生物傳感系統方面受到廣泛的關注，如上轉換納米顆粒[68-69]、MBs、QDs[70-71]、GO[72-73]和AuNPs[74-75]等，在生物材料中具有較好的熒光性能，可用于提高目標檢測的分析性能，并實現便捷的信號讀數。

3.1.1 基于MBs調節信號輸出的CRISPR/Cas-等溫擴增檢測系統

近年來MBs在分離和檢測方法中已得到了廣泛的應用，分離速率快，無需昂貴的儀器設備，在生物分子分離和純化方面表現出優異的性能，將MBs與生物傳感器相結合可以極大提高靈敏度。Li Chao等[42]開發了一種采用免疫捕獲MBs增強CRISPR/Cas12a-LAMP靈敏度的方法，用于空腸彎曲桿菌的快速視覺檢測，原理如圖4A所示。該方法在8 min內即可完成檢測，LOD低至70 CFU/mL。結果表明，免疫捕獲MBs、LAMP和CRISPR/Cas12a系統的結合可以顯著提高空腸彎曲桿菌的檢測靈敏度和特異性，這種生物傳感器也可用于檢測生物樣品中的其他病原菌，在今后的工作中具有廣泛的應用潛力。

圖4 基于納米材料調節信號輸出的CRISPR/Cas-等溫擴增檢測技術Fig.4 CRISPR/Cas-isothermal amplification technology based on nanomaterial-modulated signal output

3.1.2 基于QDs調節信號輸出的CRISPR/Cas-等溫擴增檢測系統

與傳統的猝滅劑相比，QDs 是一種吸收光譜寬、量子產率高、光穩定性好、熒光壽命長的半導體納米晶體，具有高熒光猝滅效率，已經基本取代了傳統的熒光團[76]。Zhou Baoqing等[43]合成了鏈霉親和素（streptavidin，SA）修飾的QDs作為增強熒光信號，設計了一種特殊的靶標捕獲探針，以建立基于LFB的CRISPR/Cas12a-RAA重組酶輔助擴增（CRISPR/Cas-recombinase-assisted amplification based LFB，CRA-LFB）系統。選擇穩定性較好的QDs標記LFB表現出更高的靈敏度和更低的背景干擾，提高裸眼分辨率和檢測靈敏度。目標細菌的LOD低至5.4×102CFU/mL，基于CRISPR/Cas12a的LFB平臺與QDs和ssDNA探針相結合可用于大多數病原體的檢測。基于QDs調節信號輸出方式的CRISPR/Cas系統還可以與其他的信號放大策略相結合，Liu Yaqi等[44]開發了SDA輔助的CRISPR/Cas12a電化學發光（electochemiluminescence，ECL）生物傳感器，用于金黃色葡萄球菌的超靈敏鑒定。該研究制備了卟啉Zr金屬有機骨架納米材料作為核心反應促進劑，增強QDs的反應并放大ECL發射信號。該檢測平臺表現出理想的檢測性能，具有1 fmol/L～10 nmol/L的線性范圍，檢測限為0.437 fmol/L。這種基于QDs調節信號輸出的CRISPR/Cas-等溫擴增檢測系統憑借其優異的性能可以基于不同crRNA的設計用于檢測不同的病原體和病毒，具有成本低、速度快的優勢。

3.1.3 基于GO調節信號輸出的CRISPR/Cas-等溫擴增檢測系統

GO納米材料在生物分子檢測領域越來越受到關注，具有大且易于修飾的表面，可以改性與環氧化物羥基、羧基等官能團連接，這些官能團都有助于改變GO的表面特征，并為多種分子提供附著位點，包括蛋白質、DNA、RNA等。這使GO在納米材料中的多種應用都處于有利地位，具有更好的潛在應用前景，憑借高效的熒光猝滅能力，GO已被應用在基于熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的生物傳感器中[77-78]。Cheng Xiaoxue等[79]通過集成CRISPR/Cas12系統和GO的熒光猝滅能力，開發了一種高靈敏度的熒光檢測平臺。該研究利用Cas12a高效的切割活性與GO優異的猝滅效率調節FRET，實現任何靶標DNA的檢測，LOD低至1.34×10-4nmol/L，線性范圍為5×10-4～100 nmol/L，所提出的策略也可以與其他等溫擴增方法相結合，構建靈敏度更高的生物傳感器。Wang Liu等[45]基于此原理開發了一種CRISPR/Cas12a-RPA和GO相結合的沙門氏菌視覺檢測方法。原理如圖4B所示，通過用GO調節FAM-ssDNA的熒光恢復率代替熒光團和猝滅雙標記報告基因實現熒光視覺檢測，LOD低至8×101CFU/mL，與傳統PCR擴增技術相比，檢測時間極大縮短。該方法不需要復雜的儀器，除了病原體還可應用于其他目標物質，有效提高檢測的分析性能，實現便捷的信號讀數，為未來研究CRISPR與納米材料相結合的高效生物傳感平臺提供了參考。

3.1.4 基于AuNPs調節信號輸出的CRISPR/Cas-等溫擴增檢測系統

AuNPs由于其獨特的光電特性而在生物傳感領域受到廣泛關注。CRISPR/Cas效應蛋白與金納米顆粒之間相互作用，為CRISPR的POCT提供了更為高效的診斷平臺，在其應用方面發揮較大的潛力[79]。涂有高密度生物條形碼DNA的AuNPs探針與不同的擴增技術耦合可實現第2輪信號放大，實現了比傳統酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）低1 000 倍的LOD[80]。Cai Qiqi等[46]基于此原理，將生物條形碼免疫測定（bio-barcode immunoassay，BCA）、RPA和CRISPR/Cas12a切割集成單個反應系統（稱為BCARPA-Cas12a）。如圖4C所示，在該系統中，目標細菌被大量條形碼AuNPs標記放大信號。使檢測系統的熒光在目標細菌存在下顯著增加，可以在藍光下用肉眼選擇性地檢測個位數水平的鼠傷寒沙門氏菌，LOD為1 CFU/mL。基于CRISPR/Cas12a的生物傳感器的應用范圍可以從核酸靶標擴展到非DNA靶標。因此，該方法在其他細菌檢測、食品安全監測或臨床診斷中具有巨大的進一步應用潛力。

3.2 FNAs

FNAs功能多、應用廣，是生物傳感器中發展最迅速的一個領域。FNAs由能夠結合特定靶標（稱為適配體）或具有促進化學反應能力的DNA和RNA分子（稱為DNA酶和核酶）組成[81-82]。除核酸材料的基本優點外，FNAs還有許多優越的特性，包括核酸適配體對靶標的高結合親和力，可用作靶向配體；DNA酶特異性的基因編輯能力，可精準識別靶標。這些特點使FNAs成為近幾年的熱點材料，在分子生物學和生物化學領域取得了重大進展[83]。

3.2.1 基于適配體調節信號輸出的CRISPR/Cas-等溫擴增檢測系統

使用ssDNA調節納米材料作為信號探針雖然取得了較大的成功，但具有靈敏度不足這一缺陷，需要探索一種簡單且靈敏度高的替代方案。Wei Luyu等[47]在目前的研究中開發了一種基于CRISPR/Cas12a和RPA結合的適配體比色生物傳感器，如圖5A所示，可用于超靈敏視覺檢測。當存在含有大量胞嘧啶殘基的Ag適配體時，溶液中原始游離Ag由于適配體結合而減少，導致與3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）的相互作用相應減少。利用這一原理，Ag-TMB的發色反應可以用適配體進行調節。這種生物傳感器具有令人滿意的準確性和適用性，LOD可達8 CFU/mL，更適合于細菌的鑒定與分型，實現超靈敏的快速視覺檢測。

圖5 基于FNAs調節信號輸出的CRISPR/Cas-等溫擴增檢測技術Fig.5 CRISPR/Cas-isothermal amplification technology based on FNAs-regulated signal output

3.2.2 基于G-四鏈體調節信號輸出的CRISPR/Cas-等溫擴增檢測系統

G-四鏈體是在陽離子誘導下由富含串聯重復鳥嘌呤的DNA或RNA折疊形成的高級結構，與氯化血紅素結合后具有類過氧化物酶活性，可催化TMB和2,2’-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）顯色，常作為比色信號的輸出方式。基于此原理，研究人員已經開發了相應的CRISPR/Cas-等溫擴增比色傳感平臺。Yin Lijuan等[48]巧妙設計出一種基于智能手機讀取G-四鏈體的CRISPR/Cas12-RPA生物測定法，用于細菌的超靈敏檢測。如圖5B所示，當靶標物質存在時，擴增子觸發了Cas12效應蛋白對ssDNA的降解，無法催化TMB顯色；當靶標物質不存在時，富含鳥嘌呤的ssDNA通過添加K+形成穩定的G-四鏈體DNA酶，在血紅素存在的情況下催化TMB-H2O2反應發生顏色變化，可通過肉眼或帶有顏色選擇器的智能手機直接觀察。應用該策略，沙門氏菌的LOD為1 CFU/mL。該技術擴大了CRISPR/Cas生物傳感系統的應用范圍，為食品中的病原菌提供了高靈敏度、高特異性的新型檢測平臺，可作為食源性病原菌有效的食品安全評估工具。基于同種原理，Chen Xueyun等[49]開發出一種CRISPR/Cas12a結合G-四鏈體DNA酶的視覺檢測平臺檢測食品中的副溶血性弧菌。該原理如圖5C所示，CRISPR/Cas12a-LAMP誘導G-四鏈體DNA酶催化底物ABTS顯色，裸眼檢測靈敏度為6.1×102CFU/g。這種級聯方法可以作為現場病原菌檢測的通用生物傳感策略。

4 結語

CRISPR除強大的基因編輯能力外，在生物傳感平臺也發揮出重要作用，為開發各種食源性病原菌的分析和檢測技術提供了新的策略，目前已經成為一種有效的核酸檢測工具。迄今為止，利用Cas9、Cas12、Cas13效應蛋白的順式切割活性以及Cas12和Cas13效應蛋白的反式切割活性已經開發了多種CRISPR/Cas生物傳感器，基于單一效應蛋白的快速檢測技術因其設計簡單、響應速度快而在POCT應用中發揮了巨大潛力。將多種核酸擴增技術，如LAMP、RPA、RAA、RCA等引入CRISPR/Cas傳感系統中，不僅能夠極大提高檢測的靈敏度和特異性，還可以將靶點從核酸擴展為蛋白質、微小核糖核酸、酶、外泌體等物質。通過結合納米材料、適配體、G-四鏈體等調節信號輸出方式，實現檢測信號的放大，極大提高了對食源性病原菌檢測的靈敏度。

雖然目前CRISPR在快速檢測領域已經取得了顯著的成果，但在發展過程中仍面臨許多挑戰，檢測系統存在一些局限性：1）基于CRISPR/Cas的快速檢測技術無法區分活死菌，易造成假陽性結果；針對這一弊端，可以采用適配體篩選出活死菌，但操作更加繁瑣，在未來的研究中還需要探索出更有效的方法；2）雖然具有靶點觸發側支切割活性的Cas12、Cas13、Cas14具有良好的靈敏度，但對于復雜的食品基質仍需要超高靈敏度的檢測手段，在未來的檢測中可以建立聯級CRISPR/Cas系統；3）CRISPR/Cas對于食源性病原菌仍停留在單一檢測階段，檢測效率低，實現單一體系下的多重檢測對于食品安全至關重要，在未來的研究中應該在多重檢測方面尋找新的解決方法，實現多重檢測過程的簡便化；4）目前大多數CRISPR/Cas技術在檢測前需要對核酸進行預擴增，限制了實際應用，為避免預擴增步驟，已經開發了許多一步法CRISPR/Cas檢測平臺。基于等溫擴增的CRISPR/Cas系統展示了其優越的性能，為食源性病原菌的檢測提供了新方法，在食品安全控制、分子診斷、環境檢測等領域將發揮更廣闊的應用潛力。