微生物源示蹤技術(shù)在食品鏈中進(jìn)行污染源追溯的研究進(jìn)展

樊麗華，王江雪，歐宗沅，張艷茹，張璐瑤，劉詩(shī)藝，周自梅，李國(guó)梁

（陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

隨著人口快速增長(zhǎng)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，糞便污染問(wèn)題備受關(guān)注。人與動(dòng)物的糞便通常含有多種腸道病原菌，如甲肝病毒、弧菌、沙門氏菌[1]。而未經(jīng)處理的人類排泄物和畜禽養(yǎng)殖糞便在任意堆積和排放后，經(jīng)雨水沖刷、地表徑流、地下徑流等途徑最終會(huì)進(jìn)入湖泊和海洋，從而導(dǎo)致全球水域污染[2]。水體中糞便污染致使每年全球范圍內(nèi)有大量海灘和水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)倒閉、造成食物腐爛、給人類健康造成嚴(yán)重威脅，并帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。另外，在發(fā)展中國(guó)家，很多人將帶有病原菌的河流和湖泊作為灌溉水，并將未經(jīng)處理的糞便作為農(nóng)業(yè)用肥，最終導(dǎo)致直接污染食品原材料[4]。因此，糞便污染是造成從農(nóng)場(chǎng)到餐桌整個(gè)食品鏈污染的重要因素，直接威脅食品安全。

為監(jiān)測(cè)和控制糞便污染情況發(fā)展并及時(shí)采取相應(yīng)干涉措施，傳統(tǒng)上會(huì)利用與糞便污染具有緊密關(guān)聯(lián)的糞便指示菌，如糞大腸菌、大腸埃希氏桿菌、腸球菌屬等指示污染，但這些傳統(tǒng)糞便指示物僅能反映環(huán)境受糞便污染的程度，并不能判別糞便污染的確切來(lái)源，亦不能評(píng)價(jià)各個(gè)污染源的污染貢獻(xiàn)率[5]。“治病治其根，治污需溯源”，因此，需要了解糞便污染的源頭，以對(duì)健康風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估并及時(shí)采取相應(yīng)干涉措施。水體糞便污染主要分為點(diǎn)源污染和非點(diǎn)源污染。點(diǎn)源污染是指糞便污染來(lái)源相對(duì)比較明確、通過(guò)源定位容易控制的污染，主要污染途徑有生活與工業(yè)污水排放、污水處理廠污水泄漏等[4]。相對(duì)于點(diǎn)源污染，非點(diǎn)源污染沒(méi)有固定排污地點(diǎn)，例如農(nóng)業(yè)化肥、野生動(dòng)物排泄等[3]。非點(diǎn)源污染因其隨機(jī)性、散在性、廣泛性和多樣性等特點(diǎn)給管理和監(jiān)控造成巨大困難，目前已成為全球水環(huán)境、近岸海域及水產(chǎn)品安全監(jiān)管的瓶頸[6]。為彌補(bǔ)傳統(tǒng)糞便污染監(jiān)測(cè)方法的不足，一種識(shí)別糞便污染源的新技術(shù)，即微生物源示蹤（microbial source tracking，MST）技術(shù)，已成為近年研究的關(guān)注點(diǎn)[7]。MST技術(shù)利用指示微生物本身或其特有的基因指紋或宿主特異性分子標(biāo)記作為污染源的示蹤指示物，通過(guò)比較受污染樣品與可疑糞便源中指示物的差異或其生物指示物的有無(wú)判斷是否與可疑污染源存在關(guān)聯(lián)，從而確定污染來(lái)源。MST技術(shù)不僅能識(shí)別糞便污染來(lái)源，也能評(píng)價(jià)單一污染源的污染貢獻(xiàn)率，為評(píng)價(jià)水體污染風(fēng)險(xiǎn)、控制最大排放量和制定相關(guān)政策提供依據(jù)與數(shù)據(jù)支持[8]。目前，發(fā)展中國(guó)家在非點(diǎn)源污染的MST領(lǐng)域研究甚少，對(duì)于篩選宿主特異性分子標(biāo)記作為糞便污染源的原創(chuàng)性研究更是幾乎空白。從世界范圍看，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家在污染源追蹤方面的技術(shù)均比較先進(jìn)，其中細(xì)菌源追蹤技術(shù)較成熟。目前為止，MST技術(shù)的應(yīng)用大部分集中在水體中糞便污染源的追溯，但其他方面也有更加廣泛的應(yīng)用，尤其在食源性致病菌的污染源示蹤和保證食品安全方面。

本文簡(jiǎn)要介紹MST的分類，著重闡述非依賴數(shù)據(jù)庫(kù)型方法（library-independent methods，LIMs）和分類及基于特異性分子標(biāo)記物的MST方法在食品鏈中的應(yīng)用。還對(duì)MST技術(shù)進(jìn)行了展望，以期在應(yīng)用研究中保證溯源結(jié)果更準(zhǔn)確。

1 MST的方法

MST技術(shù)能高效、快速地識(shí)別糞便污染源并及時(shí)干預(yù)，減少危害的發(fā)生[9]。其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在：1）將分子生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、生物信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)等學(xué)科有機(jī)地結(jié)合在一起，準(zhǔn)確識(shí)別環(huán)境水域中非點(diǎn)源污染，特別是糞便污染的來(lái)源；2）可有效鑒定水體中細(xì)菌污染源種類的百分比，判定其來(lái)源；3）正確評(píng)估非點(diǎn)源污染水體的污染貢獻(xiàn)率；4）明確各已知污染源與病原微生物和污染危害之間的相關(guān)性；5）用于預(yù)測(cè)各已知污染源污染物的遷移規(guī)律和擴(kuò)散途徑；6）鑒于MST的精確性，其分析結(jié)果有助于公共健康的風(fēng)險(xiǎn)管理。MST可分為依賴數(shù)據(jù)庫(kù)型方法（library-dependent methods，LDMs）和LIMs 2 類[10]。

1.1 LDMs

LDMs是指紋識(shí)別相匹配的過(guò)程，主要以微生物抗性指紋或基因多樣性指紋圖譜建立的指紋圖譜庫(kù)作為判別糞便污染來(lái)源的依據(jù)。將實(shí)際檢測(cè)得到的未知指紋與已建立圖譜庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，最終判斷宿主的確切來(lái)源。LDMs的關(guān)鍵是建立具有代表性和穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)庫(kù)，其質(zhì)量主要取決于數(shù)據(jù)庫(kù)樣本量大小、所選用的微生物種類、數(shù)據(jù)庫(kù)的代表性及均衡性。

LDMs主要有2 類數(shù)據(jù)庫(kù)方法，分別以表現(xiàn)型與基因型為基礎(chǔ)。以表現(xiàn)型為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)庫(kù)方法主要包括微生物抗生素抗性指紋分析[10]、脂肪酸甲酯分析[11]及碳源利用[12]等；以基因型為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)庫(kù)方法主要包括核酸印跡法、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳、擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析、重復(fù)序列擴(kuò)增法、多位點(diǎn)序列分型法、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜等[13]，利用這些方法判別糞便污染來(lái)源。

以常用判別分析法的同源相似率作為評(píng)價(jià)指紋圖譜庫(kù)代表性和準(zhǔn)確性的指標(biāo)[14]。LDMs的優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)污染源及其污染貢獻(xiàn)率進(jìn)行分析，然而，由于建立數(shù)據(jù)庫(kù)需要大量樣本，相對(duì)比較耗時(shí)，且耗費(fèi)大量人力和物力，導(dǎo)致LDMs的應(yīng)用受到制約[15]。

1.2 LIMs

LIMs通過(guò)檢測(cè)某一宿主源特異性標(biāo)志物的有無(wú)判別污染存在與否[16]。相比LDMs，LIMs因無(wú)需建立數(shù)據(jù)庫(kù)且簡(jiǎn)便快速、精確度高而受到推崇。

LIMs分為依賴培養(yǎng)型方法和非依賴培養(yǎng)型方法2 種（圖1），可以根據(jù)源特異性菌群進(jìn)行選擇性檢測(cè)。

圖1 基于原核生物核酸檢測(cè)的LIMs分類Fig.1 LIMs classification based on the detection of nucleic acid in prokaryotes

1.2.1 依賴培養(yǎng)型方法

依賴培養(yǎng)型方法效果直接受培養(yǎng)基的選取及培養(yǎng)條件等因素影響，因此標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)條件及相應(yīng)技術(shù)是產(chǎn)生可重復(fù)結(jié)果的前提[17]。以糞便指示菌為基礎(chǔ)的方法利用水樣中糞大腸菌類與鏈球菌的比值（FC/FS）區(qū)別人與動(dòng)物源糞便污染。然而，由于環(huán)境中糞大腸菌類與鏈球菌存活率的不同，F(xiàn)C/FS雖然可以在一定程度上反映糞便污染，但對(duì)判別污染源無(wú)明顯意義。此外，也有部分研究基于選擇性培養(yǎng)腸球菌，通過(guò)宿主特異性PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)分離的物種進(jìn)行鑒定以此識(shí)別污染。然而，仍沒(méi)有一種單一的腸球菌能夠特異性指示污染源，而基于富集腸球菌后的多重PCR也只能在一定程度上識(shí)別污染源[18]；山梨糖醇發(fā)酵型雙歧桿菌（sorbitol-fermenting bifidobacteria，SFB）方法利用人類修飾型山梨糖醇瓊脂培養(yǎng)基，從樣品中選擇性培養(yǎng)SFB，以此對(duì)污染進(jìn)行識(shí)別，此方法被認(rèn)為是一種非常有前景的人類特異性MST方法并得到廣泛應(yīng)用，然而Bonjoch等[19]指出，SFB在高溫和低堿性的水環(huán)境中僅能存活很短時(shí)間，且對(duì)樣品的采集要求較高，導(dǎo)致此方法應(yīng)用受限。嗜糞紅球菌法是一種能夠?qū)⒃谑巢輨?dòng)物糞便中的源指示菌嗜糞紅球菌進(jìn)行選擇性富集培養(yǎng)并分析以確定污染源的方法。然而，研究發(fā)現(xiàn)該指示菌雖具有較高的宿主糞便特異性且在環(huán)境中存活時(shí)間較長(zhǎng)，但它在糞便中含量較低、培養(yǎng)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，因此該方法在MST實(shí)際應(yīng)用中受到限制。

1.2.2 非依賴培養(yǎng)型方法

與依賴培養(yǎng)型方法不同，非依賴培養(yǎng)型方法主要是通過(guò)從樣品中提取核酸，進(jìn)而篩選富集目的片段（大部分為16S rRNA或基因組序列）而建立的方法[20-21]。目前此方法所涉及到的特異性糞便源指示菌主要有擬桿菌群、產(chǎn)甲烷桿菌屬、紅球菌屬、糞桿菌、致病菌腸球菌、埃希氏桿菌屬及雙歧桿菌等（表1）。

表1 不同宿主的分子標(biāo)記匯總Table 1 Summary of host-specific markers

1.2.2.1 菌群分析法

非依賴培養(yǎng)型方法主要是利用不同動(dòng)物宿主糞便中的微生物菌群結(jié)構(gòu)的不同，通過(guò)對(duì)菌群結(jié)構(gòu)分析判斷糞便樣品來(lái)源。非依賴培養(yǎng)型菌群分析方法根據(jù)分析目標(biāo)分為表型法和基因型方法2 種。

最常用的表型方法是磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acids，PLFAs）分析法，該方法的靶標(biāo)物PLFAs是細(xì)胞膜的成分，且大多情況下PLFAs決定著微生物分類。在數(shù)據(jù)分析中，通常將環(huán)境中所有的PLFAs作為整體生物信息源，將特定物種的全部PLFAs或者特定PLFAs所占比例作為目標(biāo)微生物或環(huán)境脅迫的指標(biāo)來(lái)進(jìn)行污染分析。例如，一些PLFAs可作為具有硫酸鹽還原功能菌體的分子標(biāo)記物，另一些特定脂肪酸還可以指示重度金屬污染。

基因型方法是通過(guò)宏基因組分析方法對(duì)從環(huán)境樣品中提取的DNA進(jìn)行直接分析或利用PCR方法從菌群DNA中擴(kuò)增特異性的分子標(biāo)記，隨后通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行如克隆測(cè)序（構(gòu)建基因文庫(kù)）、長(zhǎng)度多態(tài)性分析（T-RFLP、片段多態(tài)性分析、核糖體DNA限制性酶切分析、長(zhǎng)度多態(tài)片段、自動(dòng)化的核糖體基因間的間隔分析等）、探針雜交（基因芯片、微陣列等）、DNA變性（DGGE、溫度梯度凝膠電泳、單構(gòu)象鏈多態(tài)）等，從而進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析[36]?；蛐头椒ㄖ饕且?6S rRNA為目標(biāo)建立相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，且目前已形成了豐富的序列數(shù)據(jù)及大量數(shù)據(jù)庫(kù)，如核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目[37]、綠色基因數(shù)據(jù)庫(kù)（greengenes.lbl.gov）。隨著計(jì)算生物學(xué)及生物信息學(xué)的發(fā)展，可使用的數(shù)據(jù)庫(kù)已迅速發(fā)展并成為數(shù)據(jù)處理中一種嶄新的工具，且很多基因設(shè)備能為菌群分析提供所需特定工具和專業(yè)技術(shù)知識(shí)，為此檢測(cè)方法的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)[38]。然而該分析方法也存在一定缺陷，如在使用時(shí)需考慮DNA提取效率、PCR抑制及測(cè)序準(zhǔn)確性和綜合性。

1.2.2.2 與宿主有關(guān)的分子標(biāo)記方法

目前，獲取宿主特異性分子標(biāo)記的基本方法共有2 種。第1種是從源指示菌中篩選出能在一定程度上指示宿主特異性的基因，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，并對(duì)樣品糞便DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終通過(guò)產(chǎn)物序列的分析比對(duì)進(jìn)行宿主來(lái)源判斷[39]。在這種方法中，目標(biāo)微生物及其基因和具有代表性的功能基因都是已知的，其中研究最普遍的是16S rRNA基因[40]。相比之下，第2種方法中目標(biāo)基因未知，通過(guò)將宿主與非宿主的糞便DNA進(jìn)行序列對(duì)比分析，挖掘出具有宿主特異性潛力的基因，其中一些基因的功能可能未知。

目前在基于宿主特異性分子標(biāo)記的LIMs中，研究最多且應(yīng)用較為廣泛的是利用16S rRNA作為分子標(biāo)記來(lái)識(shí)別污染源。這些特異性分子標(biāo)記物主要來(lái)自擬桿菌類、雙歧桿菌類、普拉梭菌及紅球菌屬等（表1），其中擬桿菌類的16S rRNA居多[41]。另外，在動(dòng)物腸道微生物中也存在一些宿主特異性的宿主-微生物互作基因，這些基因已被用于追溯糞便污染源。例如，Shanks等[42]從牛腸道擬桿菌類基因中篩選出宿主-微生物互作基因，能夠?qū)⑴？萍S便污染與其他反芻類動(dòng)物糞便污染準(zhǔn)確區(qū)分。這些功能基因被認(rèn)為與和膜有關(guān)的分泌蛋白基因序列存在一定同源性，基于該功能基因所建立檢測(cè)方法的效果遠(yuǎn)超過(guò)以16S rRNA基因?yàn)闃?biāo)記物所建立的方法。類似地，F(xiàn)an Lihua等[43]利用宏基組學(xué)方法，富集篩選出宿主-微生物基因?qū)ωi糞便有較高的宿主特異性，以此為分子標(biāo)記物建立的檢測(cè)方法能夠高靈敏、高特異性地判別和檢出污染源。因多型擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）在人類腸道中含量豐富且與宿主存在一定程度的共生，因此也具有指示宿主特異性的潛力。Xu Jian等[44]利用B.thetaiotaomicron中參與互作反應(yīng)的α-1,6-甘露聚糖酶基因作為分子標(biāo)記用于識(shí)別人類糞便污染。一些互作基因是從其他菌群（如大腸桿菌（Escherichia coli））中篩選出[45]。盡管類似于宿主-微生物互作的功能基因表現(xiàn)出較高的宿主特異性，但是相對(duì)16S rRNA基因而言互作基因含量相對(duì)較低，意味著該基因在MST應(yīng)用過(guò)程中敏感性較差，有待進(jìn)一步的研究。

有研究指出，致病性E.coli中存在一些毒基因與宿主特異性有關(guān)[26]，如腹瀉性E.coli的毒性基因，包括牛熱不穩(wěn)定蛋白毒基因IIA（LTIIa）和豬熱穩(wěn)定蛋白毒基因II（STII）、人致病性E.coli的熱穩(wěn)定腸毒素基因（STIb）及屎腸球菌的表面蛋白基因（esp）等。利用上述毒基因?yàn)樘禺愋苑肿訕?biāo)記能分別識(shí)別牛[30]、豬[31]及人類糞便[32]污染來(lái)源（表1）。也有部分研究利用腹瀉E.coli的毒基因建立PCR檢測(cè)方法以鑒定兔（ralG）、狗（papG III）、鳥（tsh）的糞便污染，但是針對(duì)這些宿主所建立的方法在特異性及靈敏性方面還需進(jìn)一步提高（表1）。

除此之外，還有其他基因存在宿主糞便特異性，并可以作為分子標(biāo)記進(jìn)行相應(yīng)的MST研究[46]。例如，Ram等[47]對(duì)β-葡萄糖醛縮酶基因（uidA）片段進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，其中一些等位基因?qū)θ祟惣傍B類糞便表現(xiàn)出一定的特異性，并以此基因作為分子標(biāo)記開展了相應(yīng)的微生物溯源研究。古生菌中的產(chǎn)甲烷桿菌也存在一些宿主特異性基因可用于微生物溯源，如基于人類特異性的史氏甲烷短桿菌中的nifH基因、反芻動(dòng)物特異性的胃瘤甲烷短桿菌中的nifH基因及不能培養(yǎng)的豬糞便特異性產(chǎn)甲烷桿菌mcrA基因[48]（表1）。此外，因各個(gè)宿主的消化系統(tǒng)、基因型及飲食結(jié)構(gòu)的不同，一些代謝相關(guān)基因也存在一定宿主特異性，然而由于技術(shù)問(wèn)題，以此類基因?yàn)槟繕?biāo)進(jìn)行宿主糞便污染的研究相對(duì)較少。

2 基于特異性分子標(biāo)記物的MST方法在食品鏈中的應(yīng)用

2.1 基于特異性分子標(biāo)記物的MST方法在食品淡水源中的應(yīng)用

灌溉水可作為農(nóng)業(yè)用水，從根本上污染食品原材料。已有研究從灌溉水及其沉積物中分離出多種糞便污染物及病原菌E.coli、沙門氏菌屬（Salmonellaspp.）、李斯特菌屬（Listeriaspp.）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）及假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）等[49]。在部分發(fā)展中國(guó)家，即便有相關(guān)法律規(guī)定未經(jīng)嚴(yán)格處理的污水不可用于農(nóng)業(yè)灌溉，但該現(xiàn)象仍十分普遍。因此，識(shí)別灌溉水中微生物污染源，對(duì)干預(yù)并治理污染，從而確保糧食和生鮮果蔬等食品原材料的質(zhì)量安全有重要意義。Martellini等[50]利用線粒體作為分子標(biāo)記的MST方法評(píng)估所研究地區(qū)的農(nóng)田地表水受糞便污染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)水體在一定程度上受到了人類和動(dòng)物糞便的污染。García-Aljaro等[51]利用宿主特異性的擬桿菌分子標(biāo)記建立MST方法，成功區(qū)分了人類和反芻動(dòng)物糞便源，同時(shí)將該方法與水質(zhì)監(jiān)測(cè)模型結(jié)合，綜合湖中擬桿菌分子標(biāo)記和病原體（病毒、隱性孢子）的濃度，對(duì)因水質(zhì)污染產(chǎn)生的地方病和流行病發(fā)可能性進(jìn)行了評(píng)估。Fan Lihua等[22]利用已建立豬糞便特異性分子1～38和3～53對(duì)長(zhǎng)江三角洲地區(qū)水域進(jìn)行污染調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分水域存在糞便污染，且出現(xiàn)了如E.coliO157:H7，沙門氏菌屬和彎曲桿菌屬（Campylobacterspp.）等病原菌，同時(shí)表明，與傳統(tǒng)指示菌方法相比，以特異性分子1～38和3～53建立的MST方法能更好指示病原菌污染。類似地，Gomi等[52]利用腸道微生物E.coli中的宿主特異性基因（W_nqrC和W_clsA_2）作為分子標(biāo)記，用于調(diào)查廢水微生物質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2 種分子標(biāo)記的檢測(cè)特異性達(dá)98.9%，檢測(cè)結(jié)果優(yōu)于先前以人類腸道微生物E.coli為特異性分子標(biāo)記物（E.coliH8和E.coliH12）得到的結(jié)果[53]。另外，使用未經(jīng)處理的水源沖洗食品生產(chǎn)設(shè)備及接觸面也會(huì)造成食品污染。Prince-Guerra等[54]采用以擬桿菌16S rRNA為標(biāo)記物的MST方法對(duì)操作人員經(jīng)水洗滌和消毒后的手部微生物污染效果進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 組操作人員受微生物污染的手部殘留特異性病原菌無(wú)顯著差異，即洗滌或消毒對(duì)糞便污染的干預(yù)效果基本一樣。

2.2 基于特異性分子標(biāo)記物的MST方法在生鮮農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用

近幾十年來(lái)，越來(lái)越多的食源性疾病與最低限度加工的農(nóng)產(chǎn)品有關(guān)。大多數(shù)與生鮮農(nóng)產(chǎn)品相關(guān)的病原菌起源于腸道（糞便）污染，且從農(nóng)場(chǎng)到餐桌鏈的任何環(huán)節(jié)中都有可能發(fā)生。目前關(guān)于基于特異性分子標(biāo)記物的MST方法在生鮮農(nóng)產(chǎn)品中的應(yīng)用研究多集中在國(guó)外，國(guó)內(nèi)幾乎處于空白。為調(diào)查果蔬類農(nóng)產(chǎn)品受糞便污染情況，Ravaliya等[55]利用以擬桿菌16S rRNA基因建立的MST方法對(duì)生鮮果蔬中潛在的糞便污染進(jìn)行識(shí)別及溯源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在174 個(gè)樣本中，39%的通用擬桿菌標(biāo)記物（AllBac）呈陽(yáng)性，其中66%樣本來(lái)自哈密瓜農(nóng)場(chǎng)、31%樣本來(lái)自番茄農(nóng)場(chǎng)、18%樣本來(lái)自墨西哥胡椒農(nóng)場(chǎng)。在68 個(gè)AllBac陽(yáng)性樣本中，46%與人類糞便污染有關(guān)，與牛糞便無(wú)關(guān)；同時(shí)，該研究結(jié)果表明，擬桿菌屬標(biāo)記可作為新鮮農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中糞便污染的替代指標(biāo)，進(jìn)而用于確定一般污染和源自人類宿主的污染。隱孢子蟲可在多種脊椎動(dòng)物宿主中引起腸胃炎，Ahlinder等[56]基于傳統(tǒng)疾病爆發(fā)調(diào)查方法與宏基因組分析方法相結(jié)合，研究萵苣中小隱孢子蟲污染情況和來(lái)源。結(jié)果表明，基于PCR分型的MST方法在2/3的樣本中檢測(cè)到了小隱孢子蟲，且結(jié)合MST技術(shù)結(jié)果認(rèn)為種植過(guò)程中使用的污水是造成萵苣污染的重要來(lái)源。類似地，Lee等[57]將分別以人類特異性標(biāo)記分子（HF183和gyrB）和豬（PF163）、雞（CP3-49）、牛（BoBac）等動(dòng)物類特異性標(biāo)記分子建立的MST方法用于識(shí)別生鮮果蔬中糞便污染，結(jié)果表明，所有real-time PCR檢測(cè)都能對(duì)受污染的生菜進(jìn)行可靠檢測(cè)。該項(xiàng)研究對(duì)追溯生鮮果蔬中糞便污染的來(lái)源和改善農(nóng)業(yè)操作行為起到重要作用。

研究證明很多乳源性病原菌，如彎曲桿菌屬、志賀大腸桿菌、李斯特產(chǎn)單胞菌、沙門氏菌屬、耶爾森氏菌等均出現(xiàn)在農(nóng)場(chǎng)牛乳中[58]。Altalhi等[59]通過(guò)E.coli為指示菌以及從E.coli分離菌中篩選的功能性毒基因作為標(biāo)記物分析沙特阿拉伯西部Taif地區(qū)原料乳來(lái)源的細(xì)菌質(zhì)量和安全性，從而達(dá)到檢測(cè)糞大腸菌群和E.coli的自然污染情況的目的。雖然特定來(lái)源擬桿菌屬微生物源追蹤標(biāo)記已被提議作為水體糞便污染評(píng)估的替代指標(biāo)，但尚未被用于評(píng)估動(dòng)物源性食品中糞便污染情況。為調(diào)查牛乳和含乳嬰幼兒食品受微生物污染的情況，Tsai等[60]利用特定來(lái)源的擬桿菌屬分析從肯尼亞地區(qū)部分供應(yīng)商手中取得的394 份樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，護(hù)理人員手工準(zhǔn)備的乳中多次檢出標(biāo)記物，而乳制品中標(biāo)記物檢出頻率較低。此外，基于擬桿菌屬的MST技術(shù)在檢測(cè)乳制品中腸道病原菌方面的敏感性低于傳統(tǒng)基于腸桿菌科的檢測(cè)方法。盡管基于擬桿菌屬的MST技術(shù)能提供一些關(guān)于食品糞便微生物污染的信息，但卻無(wú)法預(yù)測(cè)腸道病原菌污染來(lái)源。

2.3 基于特異性分子標(biāo)記物的MST方法在海產(chǎn)品及其養(yǎng)殖環(huán)境中的應(yīng)用

水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量與安全有重要影響。然而，目前全球范圍的非點(diǎn)源污染（主要指人類和動(dòng)物排泄物）已成為影響水體環(huán)境質(zhì)量、破壞海洋生態(tài)以及導(dǎo)致水產(chǎn)品重大安全隱患的主要原因。美國(guó)約13%的天然水資源中能檢測(cè)到來(lái)自人類和動(dòng)物糞便的大量腸道指示菌污染，每年僅由于腸道病原引起的水產(chǎn)品食物中毒事件占食源性疾病的10%以上；而我國(guó)僅來(lái)自畜禽養(yǎng)殖糞便的污染就占水體污染總量的53%，因腸道致病菌（副溶血性弧菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、彎曲桿菌、甲肝病毒、諾如病毒等）引起的水產(chǎn)品食物中毒事件更是屢見不鮮[60-61]。為評(píng)估水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量，Liu Rulong等[62]采用限制性片段多態(tài)性分析方法將8 個(gè)不同宿主（人、牛、豬、馬、貓、狗、兔子、鼠）的腸道擬桿菌群16S rRNA基因序列分成6 個(gè)宿主特異性末端限制性片段（terminal restriction fragments，TRFs），利用這6 個(gè)TRFs建立MST方法，并將其用于香港地區(qū)海水中人、牛及豬等糞便污染的調(diào)查。結(jié)果表明，這6 個(gè)TRFs能作為宿主特異性分子標(biāo)記判別污染來(lái)源。此外，近年來(lái)采用宿主特異性分子標(biāo)記方法對(duì)水體和軟體貝類中人源和動(dòng)物源糞便進(jìn)行區(qū)分的研究還有很多[63-65]，這些研究一般為基于擬桿菌16S rRNA基因、F特異性RNA噬菌體（F-specific RNA bacteriophages，F(xiàn)+RNA噬菌體）、F+RNA大腸桿菌噬菌體所建立的方法。例如，Gourmelon等[27]采用基于擬桿菌16S rRNA基因的real-time PCR方法和基于特異性F+噬菌體基因分型2 種方法檢測(cè)海水和貝類中的糞便污染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2 種方法具有較高的特異性和檢測(cè)靈敏度，是檢測(cè)沿海地區(qū)水域和貝類中糞便污染的有效手段之一。Gyawali等[23]利用3 種特異性分子標(biāo)記物，包括交叉裝配噬菌體（crAssphage）、F+RNA噬菌體基因組II（F+RNA噬菌體GII）和胡椒輕斑駁病毒（PMMoV）對(duì)牡蠣和貽貝中的F+RNA噬菌體和諾如病毒污染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)crAssphage和PMMoV能準(zhǔn)確、靈敏地預(yù)測(cè)諾如病毒污染，然而，相比crAssphage和PMMoV，F(xiàn)+RNA噬菌體GII具有更高的預(yù)測(cè)特異性。因此，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為crAssphage和F+RNA噬菌體GII結(jié)合分析可以對(duì)貝類中人糞便和諾如病毒的污染提供可靠的預(yù)測(cè)。目前還有一些研究是以人和動(dòng)物腸道病毒基因?yàn)闃?biāo)記物進(jìn)行貝類收獲地區(qū)糞便污染的檢測(cè)[24,65]。

3 結(jié)論

MST技術(shù)是一種能在環(huán)境或食品樣品中高精度判別不同宿主污染源的糞便指示菌或食源性病原菌的工具，尚處于發(fā)展階段。目前MST方法已得到廣泛應(yīng)用，如用于制定相關(guān)法規(guī)、管理污染及評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)。這些應(yīng)用有助于減少與食品和水質(zhì)有關(guān)的疾病發(fā)生，并改善社會(huì)公共健康。然而，盡管許多MST方法在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中取得了良好的效果，卻仍未找到一種最有效的方法，其面臨的共同挑戰(zhàn)大致可以分為：1）方法本身的局限性，例如，只在一定的地理范圍內(nèi)對(duì)污染樣品具有較高靈敏性和特異性；2）方法的實(shí)際應(yīng)用性，如稀釋樣品的靈敏性低、存在抑制物、環(huán)境樣品中DNA擴(kuò)增效率低；3）綜合信息缺乏，如關(guān)于生物體的生態(tài)學(xué)知識(shí)、特異性標(biāo)記物在環(huán)境中持續(xù)時(shí)間及環(huán)境中糞便指示菌與病原菌的關(guān)聯(lián)性等。

為克服以上局限，接下來(lái)的微生物溯源研究應(yīng)更加注重雜交技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)及其他技術(shù)之間的相互結(jié)合，篩選并開發(fā)出具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、無(wú)交叉反應(yīng)性等特點(diǎn)的宿主特異性標(biāo)記物，保證MST技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中結(jié)果的精確有效。此外，目前大部分MST應(yīng)用研究均利用單一的宿主特異性標(biāo)記物對(duì)水體或食品鏈中特定物種進(jìn)行污染識(shí)別和溯源，所建立方法的靈敏度和特異性較低。聯(lián)合使用多種宿主特異性標(biāo)記物構(gòu)建多因子預(yù)測(cè)模型可明顯提高檢測(cè)的靈敏性和特異性，因此構(gòu)建高精確度、可以用來(lái)判別不同宿主污染來(lái)源的預(yù)測(cè)模型可成為今后研究的重點(diǎn)。