多糖的精制及環磷酰胺減毒增效機制研究進展

張彩璇，淑 英，李 楊，黃 磊，郭明珠

（河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071000）

癌癥已成為全球第3大死因，嚴重威脅人類身體健康和生命財產安全[1]。回顧2012—2020年癌癥數據，人口老齡化加劇、社會經濟迅猛發展促使我國及全球癌癥負擔日趨加重。如圖1所示，2020年我國癌癥新發病例、死亡病例分別占全球總數的24%、30%，位居全球第一[2]。作為臨床常用抗癌化療藥物之一，氮芥烷化類藥物環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）具備抗腫瘤、調節免疫、高臨床療效，廣泛應用于多種類型腫瘤、自身免疫性疾病和免疫抑制的有效治療[3-4]。CTX的體內代謝途徑有2 條[5]，其中，主要代謝途徑中CTX被肝臟中細胞色素P450酶2B6代謝為磷酰胺氮芥和丙烯醛；次要代謝途徑中細胞色素P450酶3A4催化CTX轉變為2-去氯乙基環磷酰胺和氯乙醛[6-7]。代謝產物磷酰胺氮芥通過堿化細胞核酸抑制癌細胞增殖分裂，從而發揮抗腫瘤功能；然而，丙烯醛和氯乙醛為毒性代謝產物，會損傷機體正常細胞，誘導機體免疫功能低下、氧化應激、腸道屏障及肝腎損傷、生殖抑制等[8-9]。因此，CTX臨床化療應用受到限制，有必要尋找一種安全解毒劑，以減少或消除其毒副作用。

圖1 2012—2020年全球及中國的癌癥新發病例和死亡病例Fig.1 New cancer incident cases and cancer deaths worldwide and in China between 2012 and 2020

伴隨國家對營養與健康研究開展的鼓勵，類黃酮、生物堿、皂苷、多糖等多種功能活性因子與化療藥物聯合使用以提高抗癌效果成為研究熱點[10]。作為天然膳食纖維，多糖因來源廣泛及益生元特性優勢突出，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血糖血脂、調節免疫平衡、維持胃腸道健康、預防代謝疾病等藥理活性，可作抗腫瘤劑、抗氧化劑、免疫抑制劑等[11-13]。研究表明，桑黃多糖在協同CTX抑制腫瘤生長的同時，可以減輕CTX引起的免疫功能衰退；多花黃精多糖增強CTX抑瘤作用，并通過調節炎癥因子、平衡免疫系統、緩解肝腎損傷改善不良反應[14-15]。但天然多糖因結構復雜存在精制工藝效率低、難以擴大化生產等問題。

面對多糖產業的迫切問題及CTX臨床應用的毒副作用，本文對近年新型多糖提取精制工藝進行歸類總結，同時從調節免疫、改善氧化應激、修復腸道屏障，以及保護肝腎、生殖系統等方面系統綜述多糖對CTX化療毒性的減弱作用，并分析多糖促進腫瘤細胞凋亡、抑制新生血管生長、提高免疫系統活性等機制，探討其與CTX協同抗腫瘤功能。以期為多糖作為CTX輔助劑減輕毒性、協同抗癌提供理論參考，積極推動多糖的食品精準營養與健康產業發展。

1 多糖制備技術

多糖制備技術顯著影響提取產率和分子結構，且多糖的分子結構與其生物活性密切相關，故獲取高純度多糖是闡明結構-功能關系的前提[16-17]。熱水提取（hot water extraction，HWE）法、堿提取法、酸提取法、酶輔助提取（enzyme-assisted extraction，EAE）法、超聲輔助提取（ultrasonic-assisted extraction，UAE）法、熱堿提取法提取的6 種火龍果莖多糖中，HWE法制得的火龍果莖多糖產量相對較高、分子質量及葡萄糖含量最高，表現出優異的抗氧化和降血糖活性[18]。故選擇合適的提取純化工藝對于建立多糖構效關系、促進多糖臨床藥用尤為重要。

1.1 多糖新型提取技術

傳統水提醇沉法操作簡便且成本低，適合工業規模化提取水溶中性多糖[19]。但對于某些不溶性多糖，如蘑菇中的β-葡聚糖則需要較高提取溫度及壓力才能實現有效提取[20]。此外，高分子質量多糖黏度高、溶解性差，水提效率較低[21]。因此開發了經濟可持續、高效的天然多糖新型提取技術，包括UAE、微波輔助提取（microwave-assisted extraction，MAE）、EAE、超高壓提取（ultra-high pressure extraction，UHPE）、亞臨界水提取（subcritical water extraction，SWE）、脈沖電場輔助提取（pulsed electric field-assisted extraction，PEFAE）、雙水相萃取（aqueous two-phase extraction，ATPE）、高靜水壓提取（high hydrostatic pressure extraction，HHPE）等（見表1）。

表1 多糖的新型提取方法Table 1 Novel extraction methods for polysaccharides

此外，超聲-微波輔助提取[31]、超聲-酶輔助提取[32]、超聲輔助-雙水相提取[33]、亞臨界水-多頻超聲-雙水相提取[34]等聯用技術促進優勢互補，不僅提取效率高、溶劑消耗少，且以最大限度保護多糖的生物活性。

1.2 多糖精制技術

粗多糖中可能存在色素、蛋白質、無機小分子等雜質，需分離富集多糖以便后續純化及構效關系鑒定[35]。目前常使用Sevag法、三氯乙酸法、酶法去除多糖中的蛋白質，陰離子交換大孔樹脂、H2O2溶液去除色素及無機小分子[36]。而精制方法具體分為物理純化、化學沉淀和柱層析（表2）。

表2 多糖的精制方法Table 2 Refining methods for polysaccharides

然而，僅使用單一方法難以獲得高純度多糖，實際操作中通常將多種純化技術相結合以提高多糖的純度及產率。此外，柱層析法是植物多糖最常用純化方法，膜分離、鹽析、季銨鹽沉淀等方法也具有工業應用潛力。Liu Liu等[45]研究發現，柱層析法純化金福菇多糖組分耗時8 d，而季銨鹽沉淀-超濾方法（quaternary ammonium salt precipitation-ultrafiltration，QASP-UF）只需2 d則可處理至少100 g樣品，并且QASP-UF的多糖得率比柱層析法高66.7%，具有消耗低、效率高、與后續研究靈活兼容的顯著優勢，更適合工業應用。由圖2可知，植物、動物、微生物、藻類等原材料經過提取、純化2 個循序遞進工藝后得到精制多糖。

圖2 多糖提取、分離和精制的一般流程圖Fig.2 General flow chart of extraction,separation,and purification of polysaccharides

2 多糖對CTX的減毒作用

CTX代謝產物丙烯醛、氯乙醛因不能有效區分正常細胞與腫瘤細胞，通常會抑制淋巴細胞穩態增殖和自然殺傷（natural killer，NK）細胞殺傷活力，致使細胞因子生成減少，誘導免疫功能低下[46]。丙烯醛進入細胞后激活自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生氧化應激，導致脂質過氧化、蛋白質羰基化、DNA氧化損傷，而過量的自由基又破壞免疫和炎癥相關信號通路，這可能導致機體正常細胞損傷和凋亡、器官功能下降[47]。此外，CTX可能會損害胃腸道黏膜，導致腸道通透性和潛在致病菌增加，破壞腸道穩態[48]。

2.1 調節免疫減毒

人體免疫應答包括先天性免疫和適應性免疫，并依賴于胸腺和脾臟等重要免疫器官，以及巨噬細胞、淋巴細胞、NK細胞等免疫細胞，其功能紊亂導致自身免疫性疾病、炎癥性疾病甚至癌癥[49-50]。天然活性多糖通過調節免疫減輕CTX毒副作用的機制及靶點見表3。

表3 多糖通過調節免疫減輕CTX毒副作用的機制及靶點Table 3 Mechanisms of action and targets of polysaccharides in reducing toxic side effects of CTX by regulating immune function

據報道，富含葡萄糖（glucose，Glu）、甘露糖（mannose，Man）、半乳糖（galactose，Gal）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）、果糖（fructose，Fru）的多糖易被免疫細胞上的補體受體3、甘露糖受體、Toll樣受體（toll like receptor，TLR）4、TLR2等模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別，隨后刺激分泌細胞因子，以增強宿主防御功能[56]。而天然活性多糖通常由Glu、Man、Gal、Ara等組成，因此鑒于多糖的構效關系，其免疫調節機制可能涉及多糖與PRR相互作用，觸發相應信號通路、誘導基因轉錄、促進細胞因子及Igs表達，進而發揮免疫功能。此外，從金銀花分離出的酸性多糖組分對CTX治療小鼠的細胞因子、Igs、巨噬細胞吞噬作用、NK細胞毒性的免疫調節作用顯著高于中性多糖組分，這可能歸因于酸性多糖組分的分子質量及糖醛酸含量較高[57]。目前關于多糖通過調節免疫活性減輕CTX毒性的作用機制仍有待深入研究，且多糖的免疫活性與其結構特征密切相關，需進一步探討“多糖分子結構-免疫調節活性-減輕CTX毒副作用”三者關系。

2.2 緩解氧化應激損傷減毒

CTX毒性代謝產物丙烯醛通過氧化應激途徑損傷機體氧化與抗氧化平衡系統，破壞內外環境穩態[58]。多糖可通過改善這一途徑達到減毒作用，具體機制及靶點如表4所示。

表4 多糖通過緩解氧化應激損傷減毒的作用機制及靶點Table 4 Mechanisms of action and targets of polysaccharides in reducing toxicity by alleviating oxidative stress damage

總結來看，多糖調節氧化應激多與Nrf2通路相關，Nrf2為靶向氧化應激的關鍵轉錄因子，與Keap1蛋白結合以非活性狀態穩定于細胞質中，并通過不斷的泛素-蛋白酶體途徑降解，維持低轉錄活性[65]。選擇性自噬蛋白p62通過磷酸化與Keap1蛋白競爭性結合釋放Nrf2，調節Keap/Nrf2通路[63]。多糖通過下調Keap1蛋白表達或上調p62蛋白磷酸化水平，直接或間接抑制Nrf2與Keap1蛋白的結合，促進游離Nrf2轉位入核，并識別抗氧化反應元件（antioxident response element，ARE），調控下游關鍵基因轉錄，最終影響NQO1、SOD、CAT、GSH-Px、HO-1等抗氧化酶的翻譯水平，緩解由CTX引起的氧化應激損傷。此外，線粒體凋亡途徑也被發現參與多糖的這一調控過程。多糖可通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的比例，抑制細胞凋亡，降低氧化應激水平。具體作用機制如圖3所示。

圖3 多糖對CTX誘導氧化應激損傷的改善機制Fig.3 Mechanisms of action of polysaccharides in improving oxidative stress injury induced by CTX

2.3 通過修復腸道屏障減毒

高劑量CTX治療會損傷腸道黏膜屏障功能，增加炎癥性腸病患病概率[66]。天然多糖在唾液、胃液和腸液中幾乎不被消化，而被腸道菌群編碼的碳水化合物活性酶類降解成單糖或低聚糖，并進一步消化發酵為短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）[67]。表5總結了多糖通過修復腸道屏障減毒的作用機制及靶點。

表5 多糖通過修復腸道屏障減毒的作用機制及靶點Table 5 Mechanisms of action and targets of polysaccharides in reducing toxicity by repairing the intestinal barrier

腸道屏障包括機械、生物、化學和免疫屏障，防止病原體和內毒素進入血液、其他組織和器官[68]。而SCFAs作為腸道菌群發酵多糖的主要最終產物，可促進緊密連接蛋白的表達以改善機械屏障，調節腸腔pH值抑制病原菌增殖和促進有益菌生長平衡腸道菌群以加強生物屏障，并維持腸黏膜免疫穩態，進而修復腸道屏障系統。綜上所述，多糖通過腸道菌群代謝為SCFAs，從而調控相關腸道屏障，恢復CTX處理小鼠的腸道損傷。因此基于多糖的益生作用，探究多糖與腸道菌群的相互作用，對于減輕化療藥物CTX毒性、促進機體健康具有指導意義。多糖對CTX誘導小鼠的腸道保護作用機制如圖4所示。此外研究表明，具有表面多孔結構、高分子質量以及2 種特定糖苷鍵（α-Araf-(1→和→5)-α-Araf-(1→）的多糖具有較強腸道保護作用[74]。但目前缺乏關于多糖結構-腸道屏障保護作用的系統研究，未來應重點關注二者關聯機制，為靶向篩選具有腸道屏障保護活性的多糖提供理論依據。

圖4 多糖對CTX誘導小鼠的腸道保護作用機制Fig.4 Mechanisms of action of polysaccharides in protecting against CTX-induced intestinal injury in mice

2.4 通過保肝保腎減毒

肝臟和腎臟是哺乳動物重要的代謝解毒器官，對于維持體內代謝平衡發揮著至關重要的作用[75]。而CTX的肝腎毒性主要與氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡有關。

真菌多糖因優異的保肝解毒功效而備受關注[76]。Fan Songtao等[77]分析冬蟲夏草多糖、靈芝多糖、復合真菌多糖對CTX誘導肝毒性的保護作用機制，發現3 種多糖均能降低谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、堿性磷酸酶等肝損傷標志酶含量，且抑制肝臟腫大，其中復合真菌多糖具有顯著肝臟保護作用。進一步研究發現，真菌多糖保肝作用與上調過氧化物酶體增殖物激活受體α、下調TLR9和促炎因子、增強抗氧化酶活性、調節細胞凋亡有關。由于腸道與肝臟通過腸-肝軸相互聯系，Hong Yuzhen等[66]以腸道菌群為靶點，發現涼粉草多糖對CTX誘導肝臟損傷的改善機制可能是通過增加產SCFAs的瘤胃球菌科豐度、減少產內毒素的擬桿菌屬豐度，從而抑制肝臟炎癥。

已有研究報道巖藻多糖可治療急性、慢性腎衰竭、糖尿病、腎病等多種腎臟疾病[78]。巖藻多糖降低尿素和肌酐等腎損傷標志物的含量，緩解CTX誘導小鼠的腎臟毒性，其減毒作用機制可能是通過上調Nrf2/ARE途徑激活抗氧化酶，抑制NF-κB途徑降低炎癥因子水平，進而改善腎臟損傷[79]。構效關系表明，分子質量、單糖組成、硫酸基團位置影響巖藻多糖的腎臟保護活性。因此需進一步探索巖藻多糖結構與緩解CTX腎臟毒性的關系。

2.5 通過保護生殖系統減毒

抗癌藥物CTX具有一定生殖系統毒性，嚴重時可能造成育齡患者不孕。CTX誘導的氧化應激導致女性癌癥患者卵泡中的顆粒細胞凋亡，孕酮和雌激素水平降低，卵巢功能障礙和纖維化[80]。過量ROS損傷精子DNA，影響精子形態、存活率及活力。多糖通過保護生殖系統減毒的作用機制及靶點見表6。

表6 多糖通過保護生殖系統減毒的作用機制及靶點Table 6 Mechanisms of action and targets of polysaccharides in reducing toxicity by protecting the reproductive system

氧化應激產生過量ROS，引起細胞過度自噬，導致部分正常細胞死亡。PI3K/Akt是經典的細胞抗凋亡信號傳導途徑，其活化后調控下游Bax、Bcl-2等靶標蛋白，從而清除細胞內多余ROS[85]。因此，海洋動物來源多糖可能通過啟動Keap1/Nrf2/ARE及PI3K/AKT信號通路以增強抗氧化性，平衡細胞自噬水平，從而改善氧化應激損傷，減輕CTX生殖系統毒性。

3 多糖對CTX的協同增效作用

CTX代謝產物磷酰胺氮芥與腫瘤細胞DNA發生烷基化反應，形成鏈內和鏈間DNA交聯，阻斷DNA復制，從而抑制腫瘤細胞的生長繁殖[86]。CTX還可活化巨噬細胞、NK細胞、淋巴細胞，改善樹突狀細胞抗原呈遞能力，激活免疫受體，調節免疫信號通路[87]。

多種天然活性多糖也對肝癌、胃癌、肺癌、肉瘤等實體腫瘤具有特異抑制殺傷作用。趙妙惠等[14]利用肝癌腹水荷瘤小鼠發現，CTX組、桑黃多糖組、桑黃多糖聯合CTX組的抑瘤率分別為60.29%、42.81%、71.03%，表明桑黃多糖與CTX組合使用顯著抑制腫瘤增殖和侵襲，發揮協同增效作用。多糖與CTX協同增效的常見機制包括誘導細胞凋亡直接抑制腫瘤細胞，或通過抑制新生血管生長、提高機體免疫功能等間接發揮腫瘤抑制活性。

3.1 促進腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是去除感染或受損細胞以保護細胞穩態和組織完整性的重要機制[88]。多糖聯合CTX治療腫瘤主要涉及內源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑2 種信號通路。靈芝多糖與CTX聯合處理后的抑瘤率較單獨CTX處理顯著提高17%，并可激活線粒體途徑Bax和Bcl-2，促進線粒體細胞色素C的釋放，刺激Caspase-3、Caspase-9誘導小鼠體內S180肉瘤細胞凋亡[89]。粒毛盤菌胞外多糖通過脂肪酸合成酶/凋亡相關因子配體（fatty acid synthase/factor-related apoptosis ligand，Fas/FasL）介導的Caspase依賴性途徑，與CTX協同作用于H22肝癌細胞，具有顯著抗腫瘤作用，Fas是調節細胞凋亡的關鍵因子，與FasL結合后募集Fas相關死亡域蛋白，激活Caspase-8引發下游Caspase級聯反應，啟動凋亡信號，誘導腫瘤細胞凋亡，且Fas/FasL死亡受體途徑與線粒體途徑通過BH3結構域凋亡誘導蛋白相互聯系，共同參與抗腫瘤[90]。研究表明，多糖還可通過阻滯細胞周期、誘發細胞自噬、降低細胞活力等機制直接發揮抗腫瘤作用[91]。而多糖與CTX的聯合增效研究局限于細胞凋亡，未來可深入探討其他直接靶向抑制腫瘤細胞機制。

3.2 抑制腫瘤新生血管生長

新生血管在腫瘤增殖和轉移的過程中起著關鍵作用，其生長主要受血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibrobast growth factor，bFGF）調控[92]。桑黃多糖和CTX聯合處理可通過降低小鼠肝癌組織中VEGF含量發揮潛在抗血管生成作用，從而抑制腫瘤生長[14]。粒毛盤菌胞外多糖與CTX的協同增效機制涉及信號傳導和轉錄激活因子3/缺氧誘導因子1α（signal transducer and activator of transcription 3/hypoxia inducible factor 1α，STAT3/HIF-1α）信號通路[90]。STAT3是一種促癌轉錄因子，可調控VEGF、bFGF、基質金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）2、MMP-9等表達，其中MMP-2和MMP-9可降解細胞外基質，促進血管生成，調節腫瘤的生長、黏附及運動[93]。因此，靶向STAT3信號通路減少VEGF、bFGF、MMP-2、MMP-9的表達，抑制新生血管形成、阻止腫瘤浸潤和遷移，可作為癌癥早期階段的有效治療策略。

3.3 提高免疫系統活性

腫瘤微環境中調節性T細胞、調節性B細胞、腫瘤相關巨噬細胞等免疫抑制性細胞會分泌轉化生長因子-β、IL-10、TNF-α等細胞因子，增強免疫耐受性和免疫逃逸能力，促進腫瘤生長、侵襲和轉移[94-95]。多糖增強CTX抗腫瘤作用的免疫調節機制如表7所示。

表7 多糖通過提高免疫活性增強CTX抗腫瘤作用Table 7 Polysaccharides enhance the antitumor effect of CTX by increasing immune activity

多糖與CTX聯合處理后抑瘤率整體提升，通過促進巨噬細胞吞噬作用和NK細胞活性、活化T/B淋巴細胞、調節Th1/Th2細胞平衡，激活機體細胞免疫與體液免疫，降低免疫抑制性細胞因子水平，重塑免疫微環境，聯合靶向免疫系統提高機體抗腫瘤活性。多糖與CTX協同抗腫瘤作用機制包括促進腫瘤細胞凋亡、抑制新生血管生長、提高免疫系統活性，如圖5所示。

圖5 多糖協同CTX抗腫瘤機制Fig.5 Synergistic antitumor mechanisms of polysaccharides and CTX

此外，腫瘤與抗癌藥物CTX相互作用過程中可能產生耐藥性，嚴重影響腫瘤臨床治療。而目前多糖的協同抗腫瘤研究主要集中在誘導腫瘤細胞凋亡、改善腫瘤微環境方面，缺乏逆轉多藥耐藥性作用研究，進一步探索腫瘤復雜耐藥機制能為多糖與CTX聯合治療癌癥提供新視角。

4 結語

CTX作為非特異性廣譜抗癌藥物的臨床免疫系統毒性、氧化應激毒性、腸道黏膜毒性、肝腎毒性和生殖系統等毒性問題逐漸被重視。天然活性多糖以多途徑、多靶點的優勢與CTX聯用發揮減毒及增效作用，契合“健康中國”戰略要求和人類日益增長的營養理念。此外，天然多糖對CTX的減毒增效作用與其單糖組成、糖苷鍵連接方式等基礎結構密切相關，但具體構效關系尚不完全清晰。針對不同結構與生理特性的多糖建立綠色、經濟、高效、完善的精制技術，并深層挖掘多糖結構基礎與對CTX減毒增效作用的內在關聯，是未來的研究方向。機體各器官相互關聯、多向交流，而目前多糖的減毒增效研究僅限于單方面闡明，缺乏多層次研究，故多維度探究其減毒增效機制十分必要。近年，多糖被報道通過調節腸道菌群保護腸道屏障、平衡體內能量攝入、調節機體免疫狀態，達到局部和遠端抗腫瘤作用。因此，未來可基于腸道菌群結構分析，充分探索天然活性多糖在緩解CTX毒性、增強抗腫瘤活性方面的應用，促進天然活性多糖營養強化型特殊醫學用途食品或藥品的研發，以滿足臨床需求，實現減毒增效多糖的商業化應用。