慢性牙周炎患者齦溝液miR-155、miR-21水平及其臨床意義*

郭嬌嬌,盧麗先,鞏蘭平,張學(xué)強,李 蕾,劉英奇

河北省邯鄲市中心醫(yī)院口腔科,河北邯鄲 056001

慢性牙周炎(CP)是由長期存在的牙齦炎向深部牙周組織擴展而導(dǎo)致的最常見的一類牙周炎,其主要的病理改變?yōu)檠乐艽纬珊脱啦酃俏?嚴重者會造成牙齒脫落[1]。CP好發(fā)于35歲以上人群,發(fā)病較慢、病程較長,是成年人牙齒缺失的主要原因[2]。研究顯示,CP不僅危害口腔健康,其中的致病菌還會進入人體循環(huán)系統(tǒng),可對全身多系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響[3]。微小RNA不僅調(diào)節(jié)細胞代謝、分化、凋亡等活動,還調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),部分微小RNA參與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展[4]。研究顯示,微小RNA-155(miR-155)已被證實在牙周炎患者唾液中表達上調(diào)[5]。此外,侵襲性牙周炎患者齦溝液、CP患者唾液中均檢測到微小RNA-21(miR-21)的異常高表達,并且與牙周指標以及炎癥因子水平呈正相關(guān)[6-7]。因此,推測miR-155和miR-21可能與CP患者臨床療效有關(guān)。本研究旨在檢測miR-155、miR-21在CP患者齦溝液中表達變化,分析其與牙周炎嚴重程度、臨床療效的關(guān)系,有助于改善預(yù)后。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年10月至2022年10月到本院就診的142例CP患者作為CP組,其中男81例、女61例,年齡35～70歲、平均(53.21±7.39)歲,體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(23.39±3.17)kg/m2;另選取同期本院142例健康志愿者作為對照組,其中男74例、女68例,年齡35～70歲、平均(52.73±6.23)歲,BMI為(23.44±2.83)kg/m2。兩組性別、年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。病例納入標準:符合《牙周病學(xué)》中CP相關(guān)診斷標準[8];女性患者未處于妊娠期、哺乳期、月經(jīng)期;病歷資料及隨訪資料完整。病例排除標準:合并全身系統(tǒng)性疾病,如糖尿病、高血壓;1年內(nèi)進行過正畸、手術(shù)或牙周治療;牙頸部有充填體、齲損;3個月內(nèi)有免疫調(diào)節(jié)劑、抗菌藥物、非甾體消炎藥、激素類、阿司匹林等使用史;3個月內(nèi)患急性感染疾病。本研究方案獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(審批號:20201293),所有研究對象或家屬知情研究內(nèi)容并自愿簽署同意書。

1.2方法

1.2.1牙周臨床指標檢查 由同一位口腔醫(yī)師對各組研究對象進行除第三磨牙以外的全口牙周情況檢查,并記錄以下指標:附著喪失(AL)、牙齦指數(shù)(GI)、牙槽骨吸收程度(ABL)、探診深度(PD)。每顆牙選擇頰、舌側(cè)正中、近中、遠中處檢測6個位點,最后取平均值。

1.2.2CP組牙周炎嚴重程度分組標準[9]結(jié)合AL、GI、PD及ABL檢測結(jié)果,根據(jù)牙周炎嚴重程度將CP患者進一步分組。輕度CP組:AL為1～2 mm,PD<4 mm,GI>1,牙槽骨ABL<根長1/3,牙無明顯松動,牙齦有炎癥,探診出血;中度CP組:2 mm1,根長1/3≤ABL≤根長1/2,牙出現(xiàn)輕度松動,牙齦有炎癥,探診出血,可有膿液;重度CP組:AL>4 mm,PD>6 mm,GI>1,牙槽骨ABL>根長1/2,牙出現(xiàn)多處松動,牙齦有嚴重炎癥或牙周膿腫。

1.2.3齦溝液的采集及miR-155、miR-21表達水平檢測 對照組于體檢時,CP組于入院當天采集齦溝液。將3號Whatman濾紙裁成適中大小,并消毒,將每3張濾紙條放入1個EP管中,稱質(zhì)量。于受試者頰側(cè)近中、頰側(cè)遠中、舌側(cè)近中、舌側(cè)遠中采集,用無菌棉簽將取樣部位清理干凈,氣槍吹干牙面,取無菌濾紙插入牙周袋底或齦溝袋內(nèi),30 s后取出(注意避免血液或唾液污染)放在EP管中,密封,稱質(zhì)量,貯存于-80 ℃環(huán)境中。所得質(zhì)量差按比例1 mg/μL換算成體積。檢測時先在冰上解凍,然后加入1 mL磷酸鹽緩沖液,震蕩、離心后取上清液進行RNA的提取。使用EasyPure?微小RNA試劑盒(貨號R8106,廣州捷倍斯生物科技有限公司)從齦溝液中得到微小RNA,然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號D1801,哈爾濱新海基因檢測有限公司)說明書將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)試劑盒(貨號638316,Takara公司)在7500 Fast Real-Time PCR儀器上檢測。以U6為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法計算miR-155、miR-21的表達水平。引物均由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。miR-155上游引物序列5′-GGGCCTTCCCTGGAACAGGAGTCT-3′,下游引物序列5′-GGGAGATTCATGGTATCAAGCACCC-3′;miR-21上游引物序列5′-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′,下游引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4治療方法 所有入組CP患者均給予牙周基礎(chǔ)治療:對其進行口腔衛(wèi)生宣教;協(xié)助患者掌握Bass刷牙法及牙線工具使用方法,保持口腔清潔;拔除無功能的齲齒;采用超聲齦上潔治器去除齦上牙石,1周后檢查牙周,對PD≥4 mm以上位點進行齦下刮治和根面平整;過氧化氫或生理鹽水沖洗牙周袋,齦袋內(nèi)予以碘甘油。CP組患者從治療之日起經(jīng)電話、門診復(fù)查或住院隨訪1個月。

1.2.5療效判定標準[10]顯效為牙周袋深度<2 mm,患者齦溝、牙根出血情況完全消失,咀嚼功能正常;有效為牙周袋深度2～3 mm,齦溝及牙根出血消失,咀嚼功能顯著改善,牙齒松動度降低;無效為牙周袋深度、齦溝及牙根出血癥狀無改善甚至加重。將顯效患者和有效患者歸為療效良好組,將無效患者歸為療效較差組。

2 結(jié) 果

2.1兩組齦溝液miR-155、miR-21表達水平及牙周臨床指標比較 CP組齦溝液miR-155、miR-21表達水平明顯高于對照組(P<0.05),PD、AL、ABL、GI均高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組齦溝液miR-155、miR-21表達水平及牙周臨床指標比較

2.2CP組不同牙周炎嚴重程度患者一般資料及齦溝液miR-155、miR-21表達水平比較 CP組患者分為輕度CP組49例、中度CP組53例、重度CP組40例。輕度CP組、中度CP組和重度CP組的性別、年齡、BMI比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與輕度CP組相比,中度CP組、重度CP組齦溝液miR-155、miR-21表達水平明顯升高(P<0.05);與中度CP組相比,重度CP組患者齦溝液miR-155、miR-21表達水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 CP組不同牙周炎嚴重程度患者一般資料及齦溝液miR-155、miR-21表達水平比較或n/n)

2.3CP組miR-155、miR-21表達水平與牙周臨床指標的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,CP組患者miR-155表達水平分別與ABL、PD、AL、GI呈正相關(guān)(r=0.594、0.728、0.675、0.632,P<0.05);miR-21表達水平分別與ABL、PD、AL、GI呈正相關(guān)(r=0.620、0.695、0.736、0.574,P<0.05)。

2.4CP組不同療效患者一般資料及齦溝液miR-155、miR-21表達水平比較 根據(jù)療效判定標準,分為療效良好組111例,療效較差組31例。與療效良好組相比,療效較差組齦溝液miR-155和miR-21表達水平升高,PD、AL、ABL、GI以及病情嚴重程度為重度患者的比例明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),兩組間性別、年齡、BMI、吸煙情況、飲酒情況、刷牙情況、偏側(cè)咀嚼情況比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 CP組不同療效患者一般資料及齦溝液miR-155、miR-21表達水平比較[n或

2.5影響CP患者療效的多因素Logistic回歸分析 以CP患者臨床療效為因變量(療效良好=0,療效較差=1),以單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量為自變量,由于病情嚴重程度與AL、GI、PD及ABL存在多重共線性(VIF=12.351、14.762、11.467、10.976),因此僅納入病情嚴重程度(輕度=0,中度=1,重度=2),以及miR-155(實測值)、miR-21(實測值)為自變量。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,病情嚴重程度、miR-155、miR-21是CP患者療效的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響CP患者療效的多因素Logistic回歸分析

2.6miR-155、miR-21對CP患者療效的預(yù)測價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示,miR-155、miR-21預(yù)測CP患者療效較差的曲線下面積(AUC)分別為0.937(95%CI:0.888～0.986)、0.818(95%CI:0.715～0.921),miR-155聯(lián)合miR-21預(yù)測CP患者療效較差的AUC為0.960(95%CI:0.920～0.998),略優(yōu)于miR-155單獨預(yù)測(Z=1.375,P=0.169),明顯優(yōu)于miR-21單獨預(yù)測(Z=2.895,P=0.004)。見圖1、表5。

圖1 齦溝液miR-155、miR-21預(yù)測CP患者療效的ROC曲線

表5 齦溝液miR-155、miR-21預(yù)測CP患者療效的效能

3 討 論

CP是一種細菌感染引起的炎癥性疾病,伴有牙周袋的形成、牙周支持組織的逐漸破壞,嚴重者會發(fā)生牙齒松動甚至脫落[11-12]。據(jù)報道,牙周炎是由革蘭陰性菌(如牙齦卟啉單胞菌)形成的微生物菌斑積聚引起,這些細菌含有的脂多糖(LPS)會激活Toll樣受體(TLR),進而導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的激活,誘導(dǎo)趨化因子和促炎性細胞因子的分泌,導(dǎo)致炎癥發(fā)生[13]。牙周炎患者口腔中的細菌和內(nèi)毒素容易傳播到血液中,從而導(dǎo)致全身炎癥和纖維蛋白沉積,最終對機體造成損傷[14-15]。

既往研究顯示,miR-155在炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[16-17]。miR-155還可以通過抑制干擾素(IFN)-γ分泌來抑制輔助性T淋巴細胞(Th)2分化,上調(diào)促炎性細胞因子NF-κB、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IFN-β表達,促進病原體的侵入,對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生負反饋[18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-155的異常表達在牙周損傷中起著至關(guān)重要的作用[5]。本研究中,CP組齦溝液miR-155表達水平升高,表明CP患者中miR-155呈高表達,其異常表達可能參與疾病進展。此外,有研究報道,miR-155在糖尿病伴牙周炎患者唾液中表達水平明顯高于牙周炎患者、糖尿病患者、健康對照者[20]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn),CP患者血清中miR-155表達水平與炎癥細胞因子白細胞介素(IL)-6、TNF-α呈明顯正相關(guān)[21]。本研究中CP患者齦溝液miR-155表達水平隨牙周炎嚴重程度增加而上升,與以往研究一致[20]。推測高水平miR-155通過促進炎癥細胞因子分泌,激活NF-κB,參與牙周炎進展。易志鋼等[22]研究表明,外周血miR-155預(yù)測狼瘡性腎炎合并肺部感染患者預(yù)后不良的AUC為0.843,監(jiān)測miR-155表達水平變化對于判斷患者預(yù)后有一定價值。目前有關(guān)miR-155表達水平變化與CP臨床療效關(guān)系的研究還較少。本研究結(jié)果顯示,療效較差組miR-155表達水平高于療效良好組,且miR-155是療效的影響因素,提示miR-155與CP患者臨床療效密切相關(guān),其表達水平越高,患者預(yù)后越差。因此,推測miR-155對CP患者療效判斷具有一定的前瞻性。ROC曲線分析結(jié)果顯示,miR-155預(yù)測CP患者療效較差的AUC為0.937,提示miR-155對臨床療效有一定預(yù)測價值。

miR-21在多種炎癥性疾病中異常表達,其表達上調(diào)能夠促進促炎性細胞因子產(chǎn)生而加重組織炎癥[23]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-21對LPS刺激下的巨噬細胞炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)積累的促進作用通過TLR4/NF-κB信號通路實現(xiàn),miR-21過表達可以加重神經(jīng)炎癥損傷[24]。本研究中CP組miR-21表達水平高于對照組,提示miR-21參與CP的發(fā)生、發(fā)展。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn),miR-21在牙齦假單胞菌LPS刺激的巨噬細胞中上調(diào)表達,并促進促炎性細胞因子的分泌,而上調(diào)miR-21后,促炎性細胞因子水平增加,同時促進NF-κB的激活[25]。本研究發(fā)現(xiàn)齦溝液miR-21表達水平隨牙周炎嚴重程度增加而上升,推測高水平miR-21通過促進促炎性細胞因子分泌并激活TLR4/NF-κB信號通路參與CP疾病的進展。因此,miR-21在牙周炎中具有促炎功能,可能是控制CP疾病進展的干預(yù)靶點。本研究結(jié)果顯示,療效較差患者齦溝液miR-21表達水平高于療效良好患者,推測療效較差患者機體促炎性細胞因子水平較高,機體炎癥反應(yīng)嚴重,因此miR-21表達水平升高。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示,miR-21是CP患者療效的影響因素,提示miR-21水平異常高表達參與CP患者病情進展,并可影響預(yù)后。有研究顯示,miR-21診斷慢性阻塞性肺疾病的AUC為0.844,檢測其表達有利于臨床診斷該疾病及判斷病情嚴重程度[26]。故檢測血清miR-21表達水平對預(yù)測CP患者療效具有重要意義。本研究進一步分析了miR-21單獨及聯(lián)合miR-155對CP患者療效的預(yù)測價值。ROC曲線分析結(jié)果顯示,miR-21及二者聯(lián)合預(yù)測CP患者療效較差的AUC分別為0.818、0.960,聯(lián)合檢測的AUC優(yōu)于單一指標,同時在不降低特異度的前提下,聯(lián)合檢測能顯著提高靈敏度,降低漏診率,有助于早期預(yù)測CP患者預(yù)后情況,這說明miR-155、miR-21有作為預(yù)測CP患者療效的生物標志物的潛能,有助于指導(dǎo)臨床工作。

牙周指數(shù)(ABL、GI、PD、AL)能夠反映牙周炎病情,其與炎癥程度呈正相關(guān)。羅業(yè)姣等[7]發(fā)現(xiàn),慢性牙周炎患者唾液miR-21表達水平與臨床指標(GI、PD、AL)呈正相關(guān)。WU等[5]發(fā)現(xiàn)牙周炎患者唾液中miR-155的異常高表達與牙周病嚴重程度呈正相關(guān),與GI、AL、PD呈正相關(guān)。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示,miR-155、miR-21表達水平均與ABL、GI、PD、AL呈正相關(guān),結(jié)合miR-155、miR-21與CP組患者牙周炎疾病嚴重程度有關(guān)這一推論,提示齦溝液中miR-155、miR-21異常高表達可能是CP炎癥進展的機制之一,但具體機制仍有待后續(xù)明確。

綜上所述,CP患者齦溝液中miR-155和miR-21均呈高表達,與牙周炎嚴重程度、牙周指標及臨床療效有關(guān),miR-155聯(lián)合miR-21或可成為預(yù)測CP患者療效的血清標志物。然而,本研究納入病例少,仍需要擴大樣本量對結(jié)果進行驗證,以及結(jié)合細胞模型或動物模型探討miR-155和miR-21的具體作用機制。