腹膜透析相關(guān)性腹膜炎患者腸道菌群變化研究*

何階德,黃 朦,黃存軍,劉紅玉,梁 航△

湘南學(xué)院附屬醫(yī)院:1.腎內(nèi)科;2.全科醫(yī)學(xué)科,湖南郴州 423000

慢性腎臟病(CKD)是指各種原因引起的腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙性疾病,包括腎小球?yàn)V過率正常和不正常的病理損傷、血液或尿液成分異常,以及影像學(xué)檢查異常等[1]。CKD在全球范圍的發(fā)病率逐年升高,已成為影響人類健康的一類重大疾病[2]。當(dāng)CKD患者的病情發(fā)展至終末期腎臟病(ESRD),患者通常需要選擇腎移植或透析治療[3]。其中,透析治療包括血液透析(HD)和腹膜透析(PD)。PD是利用人體內(nèi)的腹膜作為生物透析膜,依賴彌散、對(duì)流和過濾作用清除體內(nèi)潴留的水分及肌酐、尿素氮等代謝產(chǎn)物,糾正電解質(zhì)和酸堿紊亂以達(dá)到凈化血液的透析方式[4]。PD是慢性腎衰竭尿毒癥期替代治療的重要手段,近些年ESRD的發(fā)病率越來越高,PD也得到了廣泛應(yīng)用[5]。但是腹膜透析相關(guān)性腹膜炎(PDRP)是導(dǎo)致PD治療失敗的重要原因和主要并發(fā)癥,嚴(yán)重影響著PD的治療效果,制約著PD技術(shù)的發(fā)展[6]。

研究表明,CKD患者和ESRD患者的腸道微生物均發(fā)生了改變[7]。當(dāng)患者出現(xiàn)腎衰竭時(shí),大量代謝廢物不能經(jīng)腎臟排泄而蓄積于體內(nèi),可改變腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)環(huán)境,破壞腸上皮細(xì)胞,導(dǎo)致尿毒癥毒素透過腸壁血管進(jìn)入腸道,從而使腸道菌群的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、分布發(fā)生改變[8]。研究發(fā)現(xiàn),尿毒癥患者存在嚴(yán)重腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象,以具有分解和利用肌酐能力的福氏志賀菌及肺炎克雷伯菌豐度增加為特征,這是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化(高濃度的肌酐)的結(jié)果[9]。反之,腸道微生物的改變?cè)谝欢ǔ潭壬弦嘤绊慍KD的進(jìn)展并可能誘發(fā)其他疾病,如代謝產(chǎn)物尿素進(jìn)入結(jié)腸的量增加,并經(jīng)細(xì)菌脲酶轉(zhuǎn)化成氨和氫氧化銨,提高結(jié)腸pH值,繼而導(dǎo)致黏膜損傷[10]。目前尚不清楚腸道菌群是否參與PDRP的發(fā)病機(jī)制。本研究通過16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序方法分析PDRP患者與非腹膜炎PD患者的腸道菌群差異,探討PDRP患者腸道菌群的組成和多樣性變化,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2022年1—12月于本院進(jìn)行規(guī)律PD患者85例,根據(jù)是否發(fā)生PDRP分為腹膜炎組(PDRP組,40例)和非腹膜炎組(PD組,45例)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥18歲;(2)穩(wěn)定進(jìn)行PD 3個(gè)月以上;(3)有能力按要求及時(shí)、規(guī)范留取糞便及腹膜透析液標(biāo)本;(4)PDRP患者均符合《2010版腹膜透析標(biāo)準(zhǔn)操作指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)在采集標(biāo)本前半個(gè)月內(nèi)使用抗菌藥物、腸道微生態(tài)活菌制劑等;(2)合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病,如惡性腫瘤、認(rèn)知功能障礙、肝硬化、結(jié)核、心力衰竭(Ⅲ～Ⅳ級(jí))、自身免疫相關(guān)性疾病等;(3)PD同時(shí)進(jìn)行HD;(4)近3個(gè)月接受過胃腸鏡及胃腸道相關(guān)手術(shù);(5)合并其他臟器急性感染;(6)糖尿病(口服二甲雙胍)?；颊咭话阗Y料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(審批號(hào):K2021-027-01),患者均自愿參與本研究并簽署知情同意書。

表1 PD組和PDRP組患者一般資料比較或n/n或n)

1.2方法

1.2.1血液指標(biāo)檢測(cè) 在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下、PD換液前采集患者血液進(jìn)行血液檢測(cè)。血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)使用日本希森美康NX-5000血液分析儀及配套試劑盒;血清生化指標(biāo)檢測(cè)使用美國(guó)Beckman Coulter AU5821-2 全自動(dòng)生化檢測(cè)儀,血清清蛋白采用溴甲酚綠比色法檢測(cè)。

1.2.2腸道菌群測(cè)序 糞便標(biāo)本的采集:采用糞便收集盒收集非腹膜炎PD患者、PDRP患者(未應(yīng)用抗菌藥物治療之前)的新鮮糞便,置于冰盒內(nèi)運(yùn)送至標(biāo)本庫(kù),在半小時(shí)之內(nèi)將每份糞便標(biāo)本分裝為4份(0.2 g/EP管)放置于-80 ℃冰箱低溫保存。使用DNeasy PowerSoil Pro試劑盒(QIAGEN,美國(guó))和Qubit dsDNA BR試劑盒(Invitrogen,美國(guó))對(duì)糞便標(biāo)本中的腸道菌群DNA進(jìn)行提取和定量。將上述標(biāo)本利用16S rDNA 基因V3高變區(qū)擴(kuò)增與測(cè)序技術(shù)結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)腸道主要微生物進(jìn)行鑒定與分型,從而獲得非腹膜炎PD患者及PDRP患者的腸道菌群特點(diǎn)和菌種分布。

1.2.3短鏈脂肪酸檢測(cè) 采用氣相質(zhì)譜分析法測(cè)定非腹膜炎PD患者和PDRP患者糞便中短鏈脂肪酸水平。(1)將兩組患者的新鮮糞便與蒸餾水進(jìn)行同等比例稀釋,混勻,收集標(biāo)本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?2)將所得上清液進(jìn)行氣相質(zhì)譜分析,色譜條件:進(jìn)樣口溫度為220 ℃,色譜柱HP-FFAP,進(jìn)樣量為1 μL,載氣為高純度N2,0.25 mm×30.00 m,0.25 μm,初始溫度80 ℃,保持 1.5 min,按 45 ℃/min 升溫速率升溫至125 ℃,保持2.5 min,再以40 ℃/min升溫速率升溫至170 ℃,再以80 ℃ /min升溫速率升溫至225 ℃,保持 1 min。(3)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算標(biāo)本中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸水平。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清學(xué)指標(biāo)比較 與PD組患者相比,PDRP組患者血清中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和C反應(yīng)蛋白水平升高,中性粒細(xì)胞百分比增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 PD組和PDRP組患者血清學(xué)指標(biāo)比較

2.2兩組腸道菌群比較 腸道菌群的稀釋曲線顯示,所有曲線都趨于平滑并達(dá)到平臺(tái)。見圖1。為了了解PD組和PDRP組患者的關(guān)鍵菌群物種信息變化,進(jìn)一步比較了兩組患者腸道菌群在門水平的差異。與PD組患者相比,PDRP組患者表現(xiàn)出更高的厚壁菌門豐度,以及更低的變形菌門、疣微菌門、脫鐵桿菌門、彎曲桿菌門、放線菌門豐度,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外,在屬水平上,與PD組患者相比,PDRP組患者有害菌群豐度增加(P<0.05),如Eubacterium菌、羅氏菌、Absiella菌、毛螺菌,有益菌群豐度降低(P<0.05),如腸球菌、阿克曼氏菌、薩特氏菌、普雷沃氏菌豐度。見表3、4。

圖1 PD組和PDRP組患者腸道菌群多樣性比較的稀釋曲線

表3 PD組和PDRP組患者腸道菌群在門水平的分布比較

表4 PD組和PDRP 組患者腸道菌群在屬水平的分布比較

2.3腸道菌群表型和功能預(yù)測(cè) 為了揭示PDRP組和PD組之間潛在腸道菌群功能差異,利用PICRUSt2軟件并結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。圖2顯示,腸道菌群差異與信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝、碳水化合物代謝、轉(zhuǎn)錄、核苷酸代謝、輔因子和維生素代謝相關(guān)的途徑有關(guān),表明PDRP患者的腸道菌群及代謝可能與非腹膜炎PD患者存在差異。

圖2 PD組和PDRP 組患者腸道菌群功能預(yù)測(cè)比較

2.4短鏈脂肪酸水平檢測(cè) 對(duì)PD組患者和PDRP組患者糞便中短鏈脂肪酸檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與PD組相比,PDRP組患者糞便中乙酸、丙酸和丁酸水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但是,兩組糞便中甲酸水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組患者糞便中短鏈脂肪酸水平比較

2.5腸道菌群、短鏈脂肪酸與血液指標(biāo)間的相關(guān)性 患者腸道菌群與血液指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,腸道中有害菌群豐度與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比以及C反應(yīng)蛋白呈正相關(guān)(P<0.05),有益菌群豐度與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比以及C反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。糞便中短鏈脂肪酸水平與血液指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,患者糞便中乙酸、丙酸和丁酸水平與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比以及C反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。腸道菌群豐度與短鏈脂肪酸水平的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,腸道中腸球菌、阿克曼氏菌、薩特氏菌、普雷沃氏菌豐度與乙酸、丙酸和丁酸水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表6、7、8。

表6 腸道菌群與血液指標(biāo)的相關(guān)性分析(r)

表7 糞便短鏈脂肪酸水平與血液指標(biāo)的相關(guān)性分析(r)

表8 腸道菌群豐度與糞便短鏈脂肪酸水平的相關(guān)性分析(r)

3 討 論

現(xiàn)有研究很少探討PD對(duì)患者腸道菌群的影響,以及PDRP患者腸道菌群的改變。本研究發(fā)現(xiàn),與PD組相比,PDRP組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比和C反應(yīng)蛋白水平明顯增加(P<0.05),提示PDRP組患者體內(nèi)存在感染。腸道菌群測(cè)序發(fā)現(xiàn),PDRP組患者和PD組患者表現(xiàn)出腸道菌群組成上的差異,包括有益菌群豐度降低及有害菌群豐度增加。腸道菌群功能預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),腸道菌群差異與信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝、碳水化合物代謝、核苷酸代謝、輔因子和維生素代謝相關(guān)的途徑有關(guān)。此外,糞便檢測(cè)發(fā)現(xiàn),PDRP組患者糞便中短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)水平明顯降低(P<0.05)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),PDRP組患者血液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比和C反應(yīng)蛋白水平與腸道菌群和糞便短鏈脂肪酸具有相關(guān)性。

本研究中,腸道菌群的稀釋曲線顯示,所有曲線都趨于平滑并達(dá)到平臺(tái),表明測(cè)序數(shù)據(jù)量充足且合理。在門水平上,與PD組患者相比,PDRP組患者表現(xiàn)出更高的厚壁菌門豐度,以及更低的變形菌門、疣微菌門、脫鐵桿菌門、彎曲桿菌門、放線菌門豐度。在屬水平上,與PD組患者相比,PDRP組患者有害菌群豐度增加,如Eubacterium菌、羅氏菌、Absiella菌、毛螺菌,有益菌群豐度降低,如腸球菌、阿克曼氏菌、薩特氏菌、普雷沃氏菌豐度,提示紊亂的腸道菌群可能影響PDRP組患者的腸道代謝。本研究還發(fā)現(xiàn),普雷沃氏菌、阿克曼氏菌等有益菌群在PDRP組中明顯減少。阿克曼氏菌和普雷沃氏菌是人體腸道中最主要的微生物群,其在十二指腸到回腸末端的含量尤其豐富[11]。阿克曼氏菌黏附在腸黏膜上,可以維持腸黏膜的完整性,在確保腸道菌群平衡方面發(fā)揮著重要作用[12]。丁酸是主要短鏈脂肪酸——丁酸鹽的主要代謝產(chǎn)物,阿克曼氏菌豐度降低會(huì)導(dǎo)致丁酸水平降低,從而導(dǎo)致短鏈脂肪酸不足[13]。HU等[14]報(bào)道,PD降低了腸道微生物多樣性,降低了丁酸鹽相關(guān)益生菌的豐度,增加了產(chǎn)生脲酶、吲哚的微生物豐度。

研究表明,長(zhǎng)期透析、腹膜高葡萄糖暴露以及殘余腎功能喪失與PD患者腸道菌群改變及短鏈脂肪酸減少有關(guān)[15]。腸道菌群紊亂誘發(fā)的短鏈脂肪酸水平降低引起結(jié)腸pH值升高,增加腸道內(nèi)氨的產(chǎn)生和吸收,并導(dǎo)致PD時(shí)間延長(zhǎng)[16]。前期研究發(fā)現(xiàn),阿克曼氏菌能消化不易分解的植物多糖,增加短鏈脂肪酸水平以降低腸道pH值[17]。在本研究中,PDRP組中阿克曼氏菌豐度降低并伴隨較低的短鏈脂肪酸水平,表明腸道菌群的改變可能會(huì)對(duì)PDRP患者產(chǎn)生不利影響,導(dǎo)致PD患者的炎癥反應(yīng),并誘發(fā)PDRP的發(fā)生、發(fā)展。此外,在屬水平上,PDRP組中Eubacterium菌、羅氏菌、Absiella菌、毛螺菌均顯著增加,值得注意的是,毛螺菌豐度的增加與促炎性細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-6)的水平呈正相關(guān)[18]。這提示毛螺菌富集可能與PDRP患者對(duì)感染的易感性有關(guān)。對(duì)PD患者腸道中阿克曼氏菌和毛螺菌含量進(jìn)行檢測(cè),可能為PDRP的預(yù)防和干預(yù)提供新的思路。

通過PICRUSt2軟件分析得出了代謝相關(guān)信號(hào)通路改變的數(shù)據(jù)[190-20]。腸道微生物功能預(yù)測(cè)顯示,PD組的通路明顯減少,如信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝、細(xì)胞信號(hào)傳遞、輔因子和維生素代謝相關(guān)的途徑。在本研究中,PDRP患者的微生物組的功能分析表明,某些微生物物種豐度的變化在影響代謝功能和細(xì)胞反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。此外,患者腸道菌群豐度與血液指標(biāo)的相關(guān)性分析顯示:腸道中有害菌群豐度與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比以及C反應(yīng)蛋白呈正相關(guān);糞便中乙酸、丙酸和丁酸水平與白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比以及C反應(yīng)蛋白呈負(fù)相關(guān);腸道中腸球菌、阿克曼氏菌、薩特氏菌、普雷沃氏菌豐度與乙酸、丙酸和丁酸呈正相關(guān)性。這提示腸道菌群紊亂通過降低短鏈脂肪酸的水平和機(jī)體抗炎能力,增加了PDRP的易感性。此外,本研究也表明腸道菌群檢測(cè)可能為PDRP提供了新的檢測(cè)方法。同時(shí),也為靶向調(diào)控腸道菌群,改善PDRP預(yù)后提供了新的思路。

當(dāng)然,本研究有幾個(gè)不足之處。首先,盡管本研究數(shù)據(jù)顯示腸道菌群在不同的分類水平上發(fā)生了改變,但樣本量相對(duì)有限。因此,還需要進(jìn)行更多樣本量的研究。其次,所有受試者都是從一個(gè)中心招募的,本中心共享有限的地理區(qū)域,可能在受試者飲食方面存在偏差。此外,本研究沒有評(píng)估患者的飲食和藥物攝入量,因此不能排除這些因素對(duì)研究數(shù)據(jù)的影響。再次,本研究沒有多次采集患者的糞便標(biāo)本,未能更好地反映腸道菌群的動(dòng)態(tài)變化。因此,還需要更多的研究以明確腸道菌群紊亂與PRPP發(fā)生的相關(guān)性。

綜上所述,PDRP患者腸道菌群紊亂與較高的腹膜炎風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。PDRP患者腸道菌群組成的改變使研究者對(duì)PDRP的發(fā)病機(jī)制有了更深入的了解。接下來,筆者將驗(yàn)證這些紊亂是否能對(duì)PDRP進(jìn)行早期臨床診斷。值得注意的是,本研究屬于觀察性研究,受試者人數(shù)相對(duì)較少,因此這些數(shù)據(jù)不足以制訂具體的治療措施。但研究可能會(huì)驗(yàn)證腸道微生物組的因果效應(yīng),為PDRP的預(yù)防和治療提供一種新思路。