硫磺菌乙酸乙酯提取物抗氧化活性及其成分分析

朱新婷，李欣悅，余雪穎，陳永澎，高逸萱，魏奇

1.寧德師范學(xué)院海洋學(xué)院（寧德 352100）；2.福建省科技廳產(chǎn)學(xué)研合作示范基地（寧德 352100）；3.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心（寧德 352100）

硫磺菌（Laetiporus sulphureus），又名硫磺多孔菌，是我國一種食藥兼用的大型真菌，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、人體多種必需氨基酸等[1]。硫磺菌具有抗氧化、抗癌和抑菌等功效[2-3]。王娟等[4]研究發(fā)現(xiàn)，包括硫磺菌在內(nèi)的高等真菌含有多糖、酚類、黃酮、萜類等活性物質(zhì)，并且這些物質(zhì)均具有很強的生理活性。閆梅霞等[5]研究表明，硫磺菌粗多糖低、中、高劑量組均能在一定程度上抑制Lewis肺癌實體瘤，說明硫磺菌粗多糖具有抗癌的作用，并可有效保護小鼠的胸腺和臟器，在一定程度上可提高小鼠的免疫力并促進其健康生長。胡亞平等[6]研究表明，硫磺菌多糖在體外有一定的自由基清除能力，還能抑制BGC細(xì)胞的增殖，具有抗胃癌及抗氧化的能力。同時，權(quán)琳等[7]研究發(fā)現(xiàn)，硫磺菌子實體中含有的生物堿類化合物能顯著抑制小麥赤霉病菌與馬鈴薯干腐病菌，可有效避免使用多菌靈、百菌清等化學(xué)藥劑，從而減少化學(xué)農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染。有研究表明，由抗氧化劑失衡和自由基所引起的氧化應(yīng)激參與糖尿病的發(fā)展，因此抗氧化劑在治療1型和2型糖尿病具有較好前景[8]。將硫磺菌的提取物作為一種天然的無公害生物活性劑進一步開發(fā)利用，具有十分廣闊的前景。

以硫磺菌為原料，制備硫磺菌乙酸乙酯提取物，測定提取物的多糖、多酚、黃酮和三萜含量并評估其體外抗氧化活性，旨在為硫磺菌乙酸乙酯提取物在飼料、食品、藥品的實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要材料與試劑

硫磺菌，由寧德師范學(xué)院海洋學(xué)院生物活性物質(zhì)研究實驗室提供。

ABTS[2,2-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）銨鹽]、DPPH（1,1-二苯基苦基苯肼）、Trolox（水溶性維生素E），均購于北京索萊寶科技有限公司。

水楊酸、蘆丁、氯乙酸、氯化鐵、香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙酸乙酯、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、過氧化氫、鐵氰化鉀、鄰苯三酚、沒食子酸、齊墩果酸、磷酸鈉緩沖液、苯酚、濃硫酸、福林酚、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、Tris-HCl（pH 8.2，0.05 mol/L）、氯化氫，均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

MS 3 basic振蕩器（德國IKA公司）；YT2204精密電子天平（蘇州正峰電子科技有限公司）；LC-RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（湖南力辰儀器科技有限公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀有限公司）；DF-101S電熱恒溫水浴鍋（上海析牛萊伯儀器有限公司）；L550臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Unique-S20多功能超純水系統(tǒng)（廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司）；DHG-9070A鼓風(fēng)干燥箱（上海飛越實驗儀器有限公司）；Feyond-A300酶聯(lián)免疫分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 硫磺菌乙酸乙酯提取物的制備

稱取100 g硫磺菌粉，按料液比1∶10 g/mL加入乙酸乙酯，置于水浴鍋中80 ℃提取3 h，過濾去除殘渣。濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮液經(jīng)過冷凍干燥機處理后，得到硫磺菌乙酸乙酯提取物，置于-25 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 硫磺菌乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除作用

參照陳曉寧等[9]的方法測定不同濃度梯度硫磺菌乙酸乙酯提取物（62.50，125.00，250.00，500.00和1 000.00 mg/mL）對DPPH自由基的清除率。根據(jù)式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A1為樣品與DPPH反應(yīng)的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH的吸光度；A0為無水乙醇代替樣品的吸光度。

1.2.3 硫磺菌乙酸乙酯提取物對ABTS自由基的清除作用

參照孟慶煥等[10]的方法測定不同濃度梯度的硫磺菌乙酸乙酯提取物（31.25，62.50，125.00，250.00和500.00 mg/mL）對ABTS自由基清除率。計算同式（1）。式中：A1為樣品與ABTS反應(yīng)的吸光度；A2為蒸餾水代替ABTS的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.4 硫磺菌乙酸乙酯提取物對羥自由基的清除作用

參考張倩等[8]的試驗方法測定硫磺菌乙酸乙酯提取物（1.00，2.00，4.00，8.00和10.00 mg/mL）清除羥自由基能力。計算同式（1）。式中：A1為樣品組的吸光度；A2為蒸餾水代替H2O2的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.5 硫磺菌乙酸乙酯提取物還原能力的測定

參考張晨[11]的方法測定不同濃度梯度硫磺菌乙酸乙酯提取物（0.31，0.63，1.25，2.50和5.00 mg/mL）的還原力。根據(jù)式（2）計算還原力。

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為對照組的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.6 硫磺菌乙酸乙酯提取物對超氧陰離子自由基清除能力的測定

參考廖圓圓等[12]的方法測定不同濃度梯度的硫磺菌乙酸乙酯提取物（0.50，1.00，2.00，4.00和8.00 mg/mL）對超氧陰離子自由基的清除率。計算同式（1）。式中：A1為樣品組的吸光度；A2為蒸餾水代替鄰苯三酚的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.2.7 硫磺菌乙酸乙酯提取物中多糖的測定

參考王銀平[13]的方法測定硫磺菌乙酸乙酯提取物中多糖含量。分別取樣品溶液（0.5 mL）、蒸餾水（1.5 mL）、苯酚溶液（1 mL，5%）和濃硫酸（5 mL），混勻后，測定其在490 nm波長處的吸光度。

1.2.8 硫磺菌乙酸乙酯提取物中多酚的測定

參考魏奇[14]的方法測定硫磺菌乙酸乙酯提取物中多酚含量。將200 μL的樣品溶液、200 μL的福林酚和800 μL的蒸餾水混勻，然后避光靜置6 min。再加入2 mL的Na2CO3溶液（7%）和1.6 mL的蒸餾水，混勻后避光靜置90 min。測定其在760 nm波長處的吸光度。

1.2.9 硫磺菌乙酸乙酯提取物中黃酮的測定

參考張少巖等[15]的方法測定硫磺菌乙酸乙酯提取物中黃酮含量。將300 μL NaNO2溶液（5%）和5 mL樣品溶液混勻，然后靜置6 min，加入300 μL Al(NO3)3（10%）混勻，然后靜置6 min，再加入4.4 mL NaOH（4%）混勻，然后靜置12 min。測定其在510 nm波長處的吸光度。

1.2.10 硫磺菌乙酸乙酯提取物中三萜的測定

參考劉奇等[16]的方法測定硫磺菌乙酸乙酯提取物中三萜含量。將0.5 mL的樣品溶液于90 ℃揮干，冷卻后加入0.25 mL香草醛-醋酸溶液（5%）、1.5 mL高氯酸和0.4 mL蒸餾水，于60 ℃水浴15 min，再加入2.5 mL冰醋酸混勻，測定其在540 nm波長處的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用Excel統(tǒng)計收集，采用SPSS 20軟件進行顯著性分析，不同字母表示顯著性差異（P＜0.05）。取3次重復(fù)試驗的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫磺菌乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基的測定

如圖1所示，在62.50～1 000 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，水溶性維生素E能將DPPH自由基全部清除。隨著硫磺菌乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度的增加，其對DPPH自由基清除率也隨之增加。質(zhì)量濃度62.50 μg/mL時，硫磺菌乙酸乙酯提取物對DPPH清除率在測定范圍內(nèi)最低，為3.68%±1.23%，硫磺菌乙酸乙酯提取物濃度1 000 μg/mL時，清除率在測定范圍內(nèi)最高，為81.35%±0.86%。在相同質(zhì)量濃度下，硫磺菌乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除作用小于水溶性維生素E的。硫磺菌乙酸乙酯提取物的DPPH自由基清除率EC50值為604.03 μg/mL。

圖1 硫磺菌乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除能力

2.2 硫磺菌乙酸乙酯提取物清除ABTS自由基的測定

由圖2可知，質(zhì)量濃度31.25 μg/mL時，水溶性維生素E已將ABTS自由基全部清除。在31.25～500 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，ABTS自由基清除率隨著硫磺菌乙酸乙酯提取物濃度升高而升高。硫磺菌乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度31.25 μg/mL時，硫磺菌乙酸乙酯提取物清除ABTS自由基的清除率最小，為24.21%±2.41%。硫磺菌乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度500 μg/mL時，硫磺菌乙酸乙酯提取物清除ABTS自由基清除率最大，為84.78%±1.21%。在相同質(zhì)量濃度下，硫磺菌乙酸乙酯提取物對ABTS自由基的清除作用小于水溶性維生素E的。硫磺菌乙酸乙酯提取物的ABTS自由基清除率EC50值為204.96 μg/mL。

圖2 硫磺菌乙酸乙酯提取物對ABTS自由基的清除能力

2.3 硫磺菌乙酸乙酯提取物清除羥自由基的測定

由圖3可知，在1～8 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，水溶性維生素E和硫磺菌乙酸乙酯提取物對羥自由基清除能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而增強。8 mg/mL的水溶性維生素E清除羥自由基的作用與10 mg/mL的沒有顯著差異（P＞0.05）。質(zhì)量濃度1 mg/mL時，硫磺菌乙酸乙酯提取物對羥自由基的清除率達最小值（11.55%±2.45%）。硫磺菌乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，其對羥自由基清除率達最大值（67.98%±4.71%）。硫磺菌乙酸乙酯提取物的羥自由基清除率EC50值為6.95 mg/mL。

圖3 硫磺菌乙酸乙酯提取物對羥自由基的清除能力

2.4 硫磺菌乙酸乙酯提取物清除超氧陰離子的測定

如圖4所示，在0.50～8.00 mg/mL質(zhì)量濃度內(nèi)，水溶性維生素E和硫磺菌乙酸乙酯提取物對超氧陰離子自由基清除率隨其質(zhì)量濃度增加而增強。硫磺菌乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度0.50 mg/L時，其對超氧陰離子自由基清除率達最小值（13.65%±2.53%）。質(zhì)量濃度為8 mg/L時，其對超氧陰離子自由基清除率達最大值（43.60%±1.62%）。硫磺菌乙酸乙酯提取物的羥自由基清除率EC50值為9.47 mg/mL。在硫磺菌乙酸乙酯提取物質(zhì)量濃度與水溶性維生素E質(zhì)量濃度相同情況下，水溶性維生素E清除率優(yōu)于硫磺菌乙酸乙酯提取物清除率。

圖4 硫磺菌乙酸乙酯提取物對超氧陰離子的清除作用

2.5 硫磺菌乙酸乙酯提取物還原能力的測定

如圖5所示，在0.31～5.00 mg/mL范圍內(nèi)，硫磺菌乙酸乙酯提取物與水溶性維生素E的還原能力隨著質(zhì)量濃度的升高而增強。在相同質(zhì)量濃度下，硫磺菌乙酸乙酯提取物的還原能力小于水溶性維生素E的還原能力。

圖5 硫磺菌乙酸乙酯提取物的還原能力

2.6 硫磺菌乙酸乙酯提取物的活性物質(zhì)含量分析

由表1可知，在硫磺菌乙酸乙酯提取物中，多糖、多酚、黃酮、三萜的含量分別為76.27±3.29，19.15±0.66，9.12±0.41和32.41±4.03 mg/g。其中，多糖含量占比最高（76.27±3.29 mg/g），黃酮含量最低（9.12±0.41 mg/g）。

表1 硫磺菌乙酸乙酯提取物中活性物質(zhì)含量

3 結(jié)論

試驗以水溶性維生素E作為陽性對照，研究硫磺菌乙酸乙酯提取物對DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除作用及其還原能力。結(jié)果表明，硫磺菌乙酸乙酯提取物對4種自由基清除能力的EC50分別為604.03 μg/mL，204.96 μg/mL，6.95 mg/mL和9.47 mg/mL。張景等[17]研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌多糖具有清除羥自由基和DPPH自由基的作用。由此可知，食用菌具有清除自由基作用。硫磺菌乙酸乙酯提取物中多糖、多酚、黃酮、三萜的含量分別為76.27±3.29，19.15±0.66，9.12±0.41和32.41±4.03 mg/g。試驗表明，硫磺菌乙酸乙酯提取物具有一定的抗氧化能力與營養(yǎng)價值，為后續(xù)研究開發(fā)天然來源的抗氧化產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)。