紅色鄰米草菌S2-4-1HT產六氫環庚基靈菌紅素搖瓶發酵條件的優化

傅俊杰 ，李世琪，董樂 ，林曉思 ，黃兆斌，王芳

1.福建省海洋藻類活性物質制備與功能開發重點實驗室（泉州 362000）；2.泉州師范學院海洋與食品學院（泉州 362000）

靈菌紅素（prodiginines，PGs）家族是一類由三吡咯結構組成的微生物生物堿類天然紅色色素[1]。PGs家族中的靈菌紅素（prodigiosin，PG）于粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）中首次被發現[2]，并從該菌中分離出PG純品[1]。目前，PGs已被發現存在于沙雷氏菌屬（Serratia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、弧菌屬（Vibrio）等多種微生物中[3-12]。據報道，已鑒定結構的PGs包括PG、十一烷基靈菌紅素、庚基靈菌紅素（heptylprodigiosin，hPG）、間環靈菌紅素、鏈玉紅菌素B、靈菌紅素R1、壬基靈菌紅素、甲基環庚基靈菌紅素、類靈菌紅素以及鹽酸環狀靈菌紅素等[13]。此實驗室從紅色鄰米草菌（Spartinivicinus ruber）菌株S2-4-1HT中分離鑒定獲得六氫環庚基靈菌紅素（six hydrogen cycloheptane prodigiosin，ShcPG）和hPG[10]，兩種化學結構見圖1[14]。研究表明，PGs具有抗腫瘤[15]、抗炎癥細胞因子[16]和抗細菌[17]等生物活性。非常重要的是，PGs對正常細胞系具有低毒性或無毒性[17]。在PGs的研究與開發上，PG相對較為深入。PG已被用于各種癌癥的實驗藥物，且用其作為先導物合成的靈菌紅素衍生物（GX15-070或簡稱obatoclax）被用于治療晚期慢性淋巴細胞白血病的Ⅰ期臨床試驗，并被證明具有良好的安全性[18]。PGs在臨床藥物開發、環境處理、食品添加劑制備等方面具有巨大的潛在應用價值，在全球市場上占有越來越重要的地位[19]。

圖1 紅色鄰米草菌（S.ruber）菌株S2-4-1HT中分離鑒定獲得的兩種靈菌紅素的化學結構[14]

微生物生產具有環境友好、條件溫和、成本低、易于工業化的優點，因此，PGs的微生物生產被認為是其制備的發展方向[19]。高水平的微生物發酵色素產品依賴于優良的微生物菌株和有效的發酵方法。發酵生產取決于培養基組成、生產條件、發酵方法和微生物菌株等許多因素[20]，響應面法（response surface methodology，RSM）是同時考慮幾個因素變化時優化工藝參數的最常用的統計工具。RSM不僅提供了關于直接效應、成對組合交互效應和變量參數的曲線變量效應的全面知識[21]，而且省時省力。

此實驗室從紅色鄰米草菌菌株S2-4-1HT中分離鑒定了hPG和ShcPG（以下稱hPG+ShcPG），其中ShcPG為首次發現，ShcPG的含量占hPG+ShcPG總含量的70%以上，并且ShcPG對腫瘤細胞A549的半抑制濃度（half-inhibitory concentration，IC50）值為0.226 1±0.026 1 μmol/L，其抑制效果為PG的25倍、順鉑的42倍[10]。因此，ShcPG具有極高的研究價值和抗腫瘤新藥開發潛力。目前，如何優化微生物發酵條件、提高PGs產率依然是國內外學者的研究重點[22]。ShcPG的研究重點在于如何優化S.ruber菌株S2-4-1HT通過搖瓶發酵產ShcPG的工藝，以提高ShcPG的產率。此研究在前期采用RSM試驗對菌株S2-4-1HT的hPG+ShcPG搖瓶發酵培養基配方進行優化的基礎上，進一步通過單因素試驗對菌株S2-4-1HT發酵條件進行考察，在此基礎上分別通過RSM試驗對菌株S2-4-1HT的hPG+ShcPG搖瓶發酵條件進行優化，以期得到穩定可靠的菌株S2-4-1HT搖瓶發酵產hPG+ShcPG的發酵工藝參數數據，旨在為ShcPG的工業化生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅色鄰米草菌（S.ruber）菌株S2-4-1HT，此實驗室分離鑒定并保藏于中國海洋微生物菌種保藏管理中心（保藏編號：MCCC 1K03745T=KCTC 72148T），已完成對該菌株的形態學觀察、生理生化鑒定、16S rDNA鑒定。

PG（分子量：350 g/mol）、ShcPG（分子量：352 g/mol）：純度均達98%以上，實驗室純化制備，華僑大學分析測試中心核磁鑒定；金龍魚純正花生油：嘉里糧油（青島）有限公司；海生菌肉湯2216（Marine Broth 2216，MB）和瓊脂粉：生物級，美國Becton，Dickinson and Company公司；酵母粉胰蛋白胨（生物級，美國OXOID公司）；其他試劑（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

將此實驗室保存的菌株解凍后劃線接種于MB的固體培養基上，于28 ℃恒溫培養48～72 h。挑取生長狀態好的紅色單菌落于MB的液體培養基中，于28 ℃，160 r/min振蕩培養48 h，待培養液呈紅色后于4 ℃冷藏，備用。MB液體培養基的配制：在1 000 mL去離子水中加入37.4 g MB粉；MB固體培養基的配制：在每升MB液體培養基中加入15.0 g瓊脂粉。

1.2.2 發酵條件的優化

1.2.2.1 發酵培養基發酵條件單因素試驗

在前期發酵培養基優化配方（花生油、蛋白胨、無水氯化鈣、六水合氯化鎂和檸檬酸鐵的質量濃度分別為2.00，4.00，1.35，9.00和0.22 mg/mL）基礎上，主要考察溫度、培養基pH、培養基總鹽度、培養時間對hPG+ShcPG產量的影響。因素水平見表1。

表1 發酵條件單因素試驗因素水平表

1.2.2.2 發酵條件的RSM試驗設計

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，選取溫度、pH和總鹽度作為自變量，以S.ruber菌株S2-4-1HT發酵液中hPG+ShcPG質量濃度為響應值，進行三因素三水平的RSM試驗，優化搖瓶發酵hPG+ShcPG的培養條件。試驗因素和水平見表2。

表2 發酵條件優化試驗的因素水平表

1.3 發酵液中hPG+ShcPG產量的測定

1.3.1 標準曲線的繪制

以hPG+ShcPG純品為標準樣品，以其無水乙醇溶液的質量濃度為橫坐標，于535 nm波長處的吸光度（A535）為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.123 4x+0.012 5（R2=0.999 1），表明hPG+ShcPG純品質量濃度在0.547 0～7.020 0 mg/L時，A535和hPG+ShcPG的質量濃度呈現良好的線性關系。

1.3.2 發酵液中hPG+ShcPG產量的測定

發酵完成后，將S.ruber菌株S2-4-1HT發酵液和乙酸乙酯按照1∶1體積混合，充分超聲破碎菌體細胞，靜置后取8 mL上清液于10 000 r/min離心5 min。將離心后上清液全部移至另一離心管中，待乙酸乙酯揮發完全即獲得hPG+ShcPG產物。用無水乙醇溶解hPG+ShcPG產物并全部轉移到10 mL比色管中，定容至5 mL。定容后的溶液于10 000 r/min離心5 min，移取上清液，采用比色法測定溶液中的hPG+ShcPG產量。

1.4 數據處理

所有試驗的重復次數均為3次，數據表示為平均值±標準差。采用Design-Expert 8.0.6軟件對發酵培養基配方和發酵條件進行RSM試驗設計、方差分析及二次方差分析，繪制相應的等高線圖和響應曲面圖，采用Microsoft Office 2019進行基本的圖表制作、繪制單因素試驗相關曲線圖。

2 結果與分析

2.1 發酵條件單因素試驗

2.1.1 培養溫度對hPG+ShcPG產量的影響

培養溫度對S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量的影響見圖2。當溫度為22～31 ℃時，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量呈上升趨勢。當溫度大于31 ℃時，hPG+ShcPG的產量急劇下降，并且當溫度為31 ℃時，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量達最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG發酵的RSM法優化分析確定最佳工藝參數水平時，發酵溫度適合選擇在28～34 ℃。

圖2 不同培養溫度下hPG+ShcPG產量

2.1.2 培養基pH對hPG+ShcPG產量的影響

發酵培養基pH對S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量的影響見圖3。當pH為6.0～7.0時，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量呈上升趨勢。當pH大于7.0時，hPG+ShcPG的產量急劇下降，并且當pH為7.0時，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量達最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG發酵的RSM法優化分析確定最佳工藝參數水平時，發酵培養基pH適合選擇在6.0～8.0。

圖3 不同pH培養基hPG+ShcPG產量

2.1.3 培養基總鹽度對hPG+ShcPG產量的影響

發酵培養基總鹽度對S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量的影響見圖4。當總鹽度為1.0～2.5%時，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量呈上升趨勢。當總鹽度大于3.0%時，hPG+ShcPG的產量急劇下降，并且當總鹽度為2.5%時，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量達最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG發酵的RSM法優化分析確定最佳工藝參數水平時，發酵培養基總鹽度適合選擇在2.0%～3.0%。

圖4 不同總鹽度培養基hPG+ShcPG產量

2.1.4 培養時間對hPG+ShcPG產量的影響

培養時間對S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量的影響見圖5。當時間為36～48 h時，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量呈上升趨勢。當時間大于48 h時，hPG+ShcPG的產量急劇下降，并且當時間為48 h時，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量達最大值，因此在S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG發酵的RSM法優化分析確定最佳工藝參數水平時，發酵時間適合選擇48 h。

圖5 不同培養時間下hPG+ShcPG產量

2.2 發酵條件RSM法優化分析

2.2.1 發酵條件RSM法試驗設計與最佳工藝參數確定

在單因素試驗的基礎上，依據中心組合設計原理，采用三因素三水平的RSM分析法，以發酵液中hPG+ShcPG質量濃度為響應值，結果見表3。

表3 發酵條件RSM法試驗設計及結果

利用Design-Expert 8.0.6對響應面試驗結果進行二次多元回歸分析，結果見表4。hPG+ShcPG質量濃度的回歸方程為Y=4.05-1.41A+1.21B+0.71C-1.06AB-0.054AC+0.66BC-0.91A2-1.87B2-0.86C2。由表4可知，模型P＜0.01，失擬項為0.606 9，表明模型具統計學意義。此試驗所得模型決定系數R2=0.986 2，說明建立的數學回歸模型擬合度較好，校正系數Radj2=0.968 3，說明該模型可以解釋96.83%的響應值變化。試驗因素中一次項A、B、C，交互項AB、BC以及二次項A2、B2、C2對S.ruber產hPG+ShcPG的影響具統計學意義（P＜0.01），交互項AC影響無統計學意義（P＞0.05）。結果表明，相關因素對此次試驗具有較大的影響，響應值的變化不是簡單的線性關系。

表4 hPG+ShcPG發酵條件RSM中心組合設計的方差分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件，根據響應面試驗結果建立的回歸方程進行分析和擬合，得到響應面對應的等高線圖和響應曲面圖，見圖6。響應面圖中若圖形越陡峭，則說明兩因素間的交互作用影響越具統計學意義（P＜0.05），越平坦說明影響越不具統計學意義（P＞0.05）。等高線圖可以根據其圖形的形狀來判斷其交互影響的程度，若圖形為橢圓且密集則交互現象影響越具統計學意義（P＜0.05）。

圖6 溫度，pH與總鹽度對hPG+ShcPG產量影響的響應曲面圖和等高線圖

由響應面分析圖進一步分析了3個因素對S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量的作用。圖6-A和圖6-E中三維曲面圖較陡峭，且圖6-B和圖6-F中等高線圖形接近橢圓形，表明溫度與pH、pH與總鹽度的交互作用影響具統計學意義（P＜0.05）。圖6-C中三維曲面圖較陡峭，但圖6-D高線圖形接近圓形，表明溫度與總鹽度的交互作用影響不具統計學意義（P＞0.05）。

若將交互項AC從回歸方程中剔除，且將其平方和及自由度并入試驗誤差，進行第二次方差分析，結果見表5。

表5 hPG+ShcPG發酵條件RSM中心組合設計的二次方差分析

二次方差分析結果表明，各項均具統計學意義（P＜0.05）且失擬項不具統計學意義（P＞0.05），故hPG+ShcPG質量體積濃度的回歸方程為Y=4.05-1.41A+1.21B+0.71C-1.06AB+0.66BC-0.91A2-1.87B2-0.86C2。

在3個試驗因素的編碼范圍內，由Excel規劃求解得到的發酵液中hPG+ShcPG產量的最佳發酵條件為培養溫度28 ℃、pH 7.73和總鹽度2.85%。在最佳發酵培養基配方條件下hPG+ShcPG產量預測值為5.62 mg/L。

2.2.2 最佳發酵條件工藝參數驗證性試驗

在前期優化最佳培養基配方工藝（花生油、蛋白胨、無水氯化鈣、六水合氯化鎂和檸檬酸鐵的質量濃度分別為2.00，4.00，1.35，9.00和0.22 mg/mL）基礎上，培養溫度、pH和總鹽度分別為28 ℃，7.73和2.85%，發酵時間48 h，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG產量的工藝驗證值為5.71±0.12 mg/L（n=3），與預測值差異無統計學意義（P＞0.05），證明了RSM法優化S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG的最佳培養條件的可行性。

3 結論

綜合前期最佳發酵培養基配方和最佳發酵條件的試驗結果，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG的最佳發酵條件：培養基配方中花生油、蛋白胨、氯化鈣、氯化鎂和檸檬酸鐵的質量濃度分別為2.00，4.00，1.35，9.00和0.22 mg/mL，培養基pH和總鹽度分別為7.73和2.85%，發酵溫度為28 ℃，發酵時間為48 h。在此工藝下，S.ruber菌株S2-4-1HT發酵產hPG+ShcPG的產量為5.71±0.12 mg/L，是用MB培養基培養產量的22.84倍，且預測值和測定值的絕對差值＜5%，表明回歸模型可靠。此次試驗對紅色鄰米草菌S2-4-1HT發酵開發生產ShcPG具有實際應用價值。