尿素包合法富集豬油中油酸的工藝優化及降血脂作用

王佳佳，徐慧敏，孟鑫

錦州醫科大學食品與健康學院（錦州 121000）

豬油，是最常食用的動物油脂之一，我國擁有豐富的豬油資源，因其含有多種人體必需脂肪酸和高級多烯酸[1]，是一種可供開發利用的優質油脂資源。然而，因豬油中富含飽和脂肪酸，長期食用易引發高血脂、高血壓等疾病，常被認為是一種不健康食用油。有研究證明，長期只攝入植物油脂而不攝入動物油脂會食欲不振，傷口不易愈合，增加患糖尿病、貧血和心血管疾病等慢性病風險[2]，豬油與大豆油搭配食用有顯著的抗肥胖[3]和降血壓的功效[4]。豬油中含量最高的單不飽和脂肪酸——油酸，以甘油酯的形式存在于天然動、植物油中，是人體脂肪組織和血液中豐富的脂肪酸之一[5]。研究表明，在飲食中攝入適量的油酸可以減少由高脂血癥引起的心血管疾病發生的概率[6]，有助于維持心腦血管健康[7]。

為此，試驗以豬油為原材料，采用尿素包合法對豬油中的油酸進行富集，通過動物試驗，考察油酸對高脂血癥小鼠血脂代謝的影響，豐富單不飽和脂肪酸資源，為合理利用豬油資源提供新途徑，并為進一步解析油酸降血脂機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬油（實驗室自制）；氫氧化鈉、尿素、95%乙醇、硫酸、無水硫酸鈉、正己烷（均為分析純）；正己烷、甲醇（色譜純）。

60只雄性昆明小鼠（購于錦州醫科大學動物實驗中心），體重20～25 g；甘油三酯（TC）試劑盒、總膽固醇（TG）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，南京建成生物研究所；膽固醇、膽酸鈉（食品級，佳味源實業有限公司）；豬油（自制）；蛋黃粉（食品級，萬邦化工科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

XD-52AA型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH-2A型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；GCMS6800氣相色譜-質譜聯用儀（安捷倫科技有限公司）；Readmax1900型光吸收全波長酶標儀（上海閃譜生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 油酸富集的工藝優化

稱取30 g豬油，加入到一定濃度的氫氧化鈉-乙醇溶液中加熱回流，回流過程中加入蒸餾水，使皂化液充分溶解，待皂化液冷卻后，用20%硫酸調節pH 2～3左右，移入分液漏斗，加入正己烷萃取，萃取液沖洗至中性，加入無水硫酸鈉干燥過濾，用旋轉蒸發儀旋蒸獲得混合脂肪[8]。

將95%乙醇與尿素添加到圓底燒瓶中，在80 ℃水浴鍋中加熱回流，待尿素全部溶解后，將混合脂肪酸加入其中，加熱回流40 min，待混合物冷卻到室溫，于低溫下包合一段時間[9]。包合結束后，迅速抽濾，取出濾液，旋蒸除去乙醇，用硫酸調節pH 2～3，加入正己烷萃取，將有機相調節至中性，用無水硫酸鈉干燥過濾，旋蒸后得到包合后的混合脂肪酸[10]。油酸得率按式（1）計算。

1.3.2 響應面優化試驗

1.3.2.1 響應面法優化油酸富集工藝

在單因素試驗基礎上，選取包合時間（A）、脲酯比（B）、醇脲比（C）為考察因素，以油酸得率（Y）為響應值，利用Design-Expert 13軟件的試驗設計原理，以油酸得率作為評價指標，進行三因素三水平的響應面試驗分析，響應面試驗因素水平見表1。

表1 油酸富集工藝響應面試驗因子水平及編碼

1.3.2.2 脂肪酸甲酯化

取50 mg脂肪酸，加入5 mL正己烷，溶解后加入0.8 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，于30 ℃水浴15 min，經無水硫酸鈉干燥后，吸取上清液，經0.22 μm濾膜過濾，進樣分析。

1.3.2.3 GC-MS條件

色譜柱為J&W DB-5石英毛細柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序：初始溫度150 ℃，持續1 min，以5 ℃/min升溫至210 ℃，持續3 min，以5 ℃/min升至250 ℃；流速1 mL/min；分流比10∶1，高純氦為載氣。電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃。脂肪酸相對含量由峰面積相對歸一法確定。

1.3.3 油酸對高脂血癥小鼠血脂代謝的影響

1.3.3.1 試驗小鼠分組

60只昆明小鼠（SPF級）飼養在恒溫24 ℃環境中，每組10只，隨機分為6組。適應性喂養1周后，1組作為空白對照組飼喂基礎飼料，其他5組均飼喂高脂飼料（70%基礎飼料、15%豬油、10%蛋黃粉、3%膽固醇和2%膽酸鈉），飼喂4周后，采血獲得血清，檢測血脂水平，判斷高脂血癥模型建立是否成功。模型建造成功后，繼續高脂飼料飼喂，高脂模型組僅飼喂高脂飼料，低、中、高劑量油酸組每天分別灌胃2，4和8 g/kg油酸，陽性藥物組灌胃5 mg/kg辛伐他汀，連續灌胃4周。此期間小鼠自由飲食飲水直至灌胃結束。

1.3.3.2 小鼠指標的檢測

灌胃結束后，所有小鼠禁食不禁水24 h，采血，靜置2 h后，按6 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，于-20 ℃保存。檢測血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量。

1.3.3.3 小鼠肝臟組織切片觀察

小鼠肝臟組織經多聚甲醛固定后，采用蘇木-伊紅染色后，通過熒光顯微鏡觀察小鼠肝組織病理變化。

1.3.4 數據處理

采用Excel、SPSS 26.0、Design Expert 13數據分析軟件對數據進行統計分析并繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗結果與分析

2.1.1 模型建立與數據分析

結合單因素試驗的結果，依據Design-Expert 13軟件的試驗設計原理，以油酸得率（Y）為響應值，包合時間（A）、脲酯比（B）、醇脲比（C）為自變量，設計三因素三水平Box-Behnken中心組合試驗，試驗設計方案及結果見表2，對試驗數據進行多元回歸擬合，進行通過回歸分析，得到各因素與油酸得率方程式：油酸得率=55.85-2.48A-1.95B-0.450 0AB-0.742 5AC+2.04BC-5.68A2-4.10B2-5.06C2。

表2 響應面試驗設計及結果

方差分析結果如表3所示。該二次方程模型方差分析模型顯著（P＜0.05），失擬項P值為0.847 0，不顯著，證明該方程與試驗的失擬較小，結果能夠較好反映出試驗的真實性。由F值可知，各因素對油酸得率影響次序為B＞A＞C。根據Design Expert 13給出的回歸方程，得出油酸富集的最佳工藝條件：包合時間8.00 h、醇脲比4.27∶1，脲脂比1.7∶1。在此條件下，油酸最大得率53.28%。

表3 回歸模型方差分析

2.1.2 響應面分析

響應面線圖能直接反映兩因素交互影響的程度，2個因素之間交互作用越顯著，曲面圖變化幅度越大。油酸得率A、B、C之間兩兩交互作用的響應面分析如圖1所示。與P值相結合可得，兩兩因素交互作用顯著程度順序為BC＞AC＞AB。

圖1 響應面交互作用分析圖

2.2 油酸對高脂血癥小鼠的血脂代謝影響

2.2.1 油酸對高脂血癥小鼠血脂代謝的影響

由圖2可知，高脂模型組小鼠血清中HDL-C含量極顯著低于空白組（P＜0.01），而TC、TG、LDL-C水平極顯著高于空白組（P＜0.01）。低、中、高灌胃劑量組TG、TC、LDL-C均有不同程度降低且呈現劑量-依賴性下降，3組均與模型組有極顯著差異（P＜0.01）。油酸低、中劑量組HDL-C含量極顯著高于高脂模型組（P＜0.01），高劑量組HDL-C水平略微低于中劑量組，但仍顯著高于高脂模型組。

圖2 油酸對小鼠血脂代謝影響

試驗結果表明，油酸能夠降低高脂血癥小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，從而改善高脂血癥小鼠的血脂代謝異常，對高脂食物誘導的代謝綜合征有一定治療作用，可以在降血脂方面提供新的選擇，并為進一步研究油酸的降血脂機制提供方向。

2.2.2 油酸對高脂血癥小鼠肝臟組織的影響

對各組小鼠的肝臟切片觀察結果見圖3。空白組小鼠肝臟組織細胞形態正常，結構清晰，未見脂肪空泡；高脂模型組小鼠肝臟組織細胞排列混亂，可見大滴脂肪空泡，脂肪化程度較高。藥物陽性對照組切片未見脂肪空泡，細胞排列整齊。與模型組相比，低中劑量組，脂肪空泡數量逐漸減少，偶可見較小脂滴，脂肪化程度減小；高劑量組改善效果尤為明顯，細胞邊界清晰，排列整齊，未見脂肪空泡，肝細胞基本恢復正常，與陽性藥物對照組接近。

圖3 小鼠肝臟組織HE染色切片觀察結果（200×）

試驗證明肝臟病變程度隨油酸劑量增大而減小，油酸對高脂血癥小鼠肝臟具有一定保護作用，可以減小肝臟的病變程度。

3 結論

以豬油為原料，采用尿素包合法對豬油中的油酸進行富集，通過單因素試驗和響應面法相結合探究包合時間、脲脂比、醇脲比對油酸富集結果的影響。油酸富集最佳工藝條件為包合時間8.00 h、醇脲比4.27∶1，脲脂比1.7∶1，油酸得率最大（53.28%）。將優化工藝獲得的油酸飼喂高脂血癥小鼠，能夠顯著降低高脂血癥小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平，對飲食引起的血脂增高有較好的改善作用，對高脂血癥具有一定預防作用，可作為一種優質的具有降血脂功能的食品資源，為進一步拓展豬油在食品加工中應用奠定基礎。