富硒乳酸菌的制備

陳丹，曹亞莉，劉文雅，苗夢雅，畢小惠，王爍騫

商丘市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究中心（商丘 476000）

硒（Se）是人體所必需的微量元素，具有抗氧化、調(diào)節(jié)生長發(fā)育和抗病毒等作用。每天攝入足夠量的硒，其類似于人體每日所需要的蛋白質(zhì)和維生素[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物機(jī)體中的胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），硒是必需的組成元素[2]。硒元素的安全攝入量范圍非常小，大于400 μg/d時(shí)，將可能出現(xiàn)中毒[3]。

益生菌（Probiotics）指有益活性的微生物，機(jī)體攝入之后，可以產(chǎn)生更多本身有的基本營養(yǎng)價(jià)值，具有保健作用[4]。益生菌能促進(jìn)生長、提高營養(yǎng)物的利用率以及預(yù)防腹瀉[5]。較無機(jī)硒，有機(jī)硒更容易被人體吸收且毒性低。益生菌將無機(jī)硒有機(jī)化，使其與體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，由此得到富硒益生菌，這樣可以兼具有機(jī)硒和益生菌的作用[6]。研究表明富硒益生菌可以促進(jìn)生長、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老以及預(yù)防疾病[7]。國內(nèi)外市場上的大多數(shù)產(chǎn)品中富硒和益生菌是兩個(gè)單獨(dú)的產(chǎn)品概念。少數(shù)產(chǎn)品同時(shí)提出富硒和益生菌2個(gè)概念，采用的方式是將含硒化合物與益生菌混合，試驗(yàn)以富硒益生菌為載體開發(fā)新產(chǎn)品，兼具益生菌和富硒2項(xiàng)功能，具有創(chuàng)新性。

1 方法

1.1 試驗(yàn)試劑與設(shè)備

主要試劑信息見表1。

表1 試驗(yàn)用試劑列表

試驗(yàn)主要儀器設(shè)備如表2所示。

表2 主要儀器設(shè)備

1.2 技術(shù)路線（圖1）

圖1 技術(shù)路線

1.3 富硒菌種的培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

考察的因素有碳源添加量、氮源添加量、復(fù)合氮源添加比例、無機(jī)鹽添加量。借助正交設(shè)計(jì)助手軟件，根據(jù)表3和表4，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。離心發(fā)酵液，收集菌體，于65 ℃烘干至恒重。

表3 因素水平表

表4 各試驗(yàn)組培養(yǎng)基配比

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒益生菌篩選試驗(yàn)硒含量測定結(jié)果

由表5可得，硒添加量在0～1 000 mg/kg范圍時(shí)，嗜酸乳桿菌的硒含量均為最高。因此，嗜酸乳桿菌的耐硒能力最強(qiáng)。

表5 試驗(yàn)菌株凍干粉的硒含量測定結(jié)果

硒濃度低于0.1 mg/kg時(shí)，各試驗(yàn)組的硒濃度差異不顯著。硒濃度增加到1 mg/kg時(shí)，嗜酸乳桿菌的硒含量與其他3種菌的硒含量差異均極顯著，這可能是因?yàn)檫@個(gè)濃度的硒對其他3種乳酸菌的增殖影響較大，是一個(gè)界限值，而對嗜酸乳桿菌的增殖影響不顯著。硒濃度添加量10 mg/kg時(shí)，硒濃度已對4種乳酸菌的增殖都產(chǎn)生明顯影響，植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌對高濃度的硒有較強(qiáng)的耐受性。硒濃度添加量高于100 mg/kg時(shí)，嗜酸乳桿菌的硒含量與植物乳桿菌的硒含量仍然差異不顯著。結(jié)果表明植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌對高濃度的硒的耐受性較高，但嗜酸乳桿菌的硒含量較植物乳桿菌仍稍高。

2.2 富硒菌種生長曲線的測定結(jié)果

由圖2可得，0～2 h為適應(yīng)期，2～6 h為對數(shù)期，6 h至試驗(yàn)10 h均為穩(wěn)定期，試驗(yàn)未測量嗜酸乳桿菌的衰亡期。

圖2 嗜酸乳桿菌的生長曲線

2.3 富硒菌種的培養(yǎng)基優(yōu)化

由試驗(yàn)可得，嗜酸乳桿菌的最佳培養(yǎng)基配比為蔗糖總添加量5%，蛋白胨與酵母膏添加比例3∶2，牛肉膏與蛋白胨總添加量0.35%，K2HPO4總添加量0.1%。

2.4 嗜酸乳桿菌的富硒菌種的制備結(jié)果

由表6和表7可得，添加的硒溶液硒含量為0.2，1和16 mg/kg時(shí)，嗜酸乳桿菌凍干粉的硒含量平均數(shù)分別為53.46，541.01和5 779.45 mg/kg，符合菌種硒含量的要求，即硒含量在5×103～6×103，5×102～6×102和50～60 mg/kg范圍之內(nèi)。

表6 嗜酸乳桿菌梯度富硒試驗(yàn)1硒含量結(jié)果

表7 嗜酸乳桿菌梯度富硒試驗(yàn)2硒含量結(jié)果

2.5 嗜酸乳桿菌增殖培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.5.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，試驗(yàn)得到得率及硒含量，如表8所示。

表8 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

表9 得率的回歸模型方差分析結(jié)果

2.5.2 回歸模型的建立與方差分析

對17組數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得率擬合方程為得率=67.640 03+0.168 72A+12.476 57B+22.317 26C+3.608 59×10-4AB+2.247 85×10-4AC+1.041 77BC-2.839 96×10-5A2-0.648 12B2-3.020 77C2（R2=0.955 8），其中A為菌種含硒量，B為加硒量，C為加硒時(shí)間。

結(jié)果顯示：A、A2及C2項(xiàng)極顯著；BC和B2項(xiàng)顯著。由回歸模型的F值為16.82可知，該方程極顯著。另外，由F值結(jié)果表明三因素對得率影響次序?yàn)锳＞C＞B。最影響得率的因素是菌種硒含量，這是由于菌種對加硒環(huán)境的適應(yīng)能力起決定作用[8]，菌種對高硒環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，得率越高。

對上述17組數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，硒含量擬合方程為硒含量=-19 778.721 80+6.599 31A+2 199.822 67B+1 926.372 62C-0.018 895AB-0.082 680AC+6.753 85BC-9.921 54×10-4A2-71.522 83B2-134.657 47C2（R2=0.968 6），其中A為菌種含硒量，B為加硒量，C為加硒時(shí)間。

表10結(jié)果顯示：A2、B2及C2項(xiàng)極顯著；C和AC項(xiàng)顯著。由回歸模型的F值為23.95可知，該方程極顯著；另外，由F值結(jié)果表明三因素對硒含量影響次序?yàn)镃＞B＞A。最影響硒含量的因素是加硒時(shí)間，這是由于菌種對加硒環(huán)境的適應(yīng)能力起決定作用[9]，菌種對高硒環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，得率越高，而增加環(huán)境硒含量的時(shí)間越早越不利于菌體對硒的富集[10]。

表10 硒含量的回歸模型方差分析結(jié)果

2.6 最優(yōu)制備工藝的確定

運(yùn)用Design Expert軟件，得到得率最高的最優(yōu)工藝：菌種硒含量2 902.81 mg/kg，加硒量15.30 mg/kg，加硒時(shí)間6.64 h。由該反應(yīng)條件可以得到得率為498.46 mg/kg，硒含量為13 039.62 mg/kg。為檢驗(yàn)以上最優(yōu)工藝的可靠性，采用最優(yōu)條件制備富硒嗜酸乳桿菌凍干粉，測定得到富硒嗜酸乳桿菌凍干粉的得率為466.67±33.33 mg/kg，與理論預(yù)測值相比相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.14%。硒含量為13 003.01±299.12 mg/kg，與理論預(yù)測值相比相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.30%。因此，此優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

根據(jù)富硒乳酸菌的篩選試驗(yàn)結(jié)果，嗜酸乳桿菌的富硒能力優(yōu)于其他3種乳酸菌。通過對嗜酸乳桿菌的生長曲線的測定及硒含量對嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硒添加量0～1 000 mg/kg時(shí)，發(fā)酵8 h后，嗜酸乳桿菌凍干粉的活菌數(shù)的數(shù)量級(jí)均能達(dá)到千億級(jí)（即1×1011）。優(yōu)化益生菌的培養(yǎng)基配方，最優(yōu)增殖培養(yǎng)基配方為蔗糖總添加量5%，蛋白胨與酵母膏添加比例3∶2，蛋白胨與酵母膏總添加量0.35%，K2HPO4總添加量0.1%。優(yōu)化富硒益生菌的發(fā)酵工藝，得到嗜酸乳桿菌的最佳富硒工藝：菌種硒含量2 902.81 mg/kg，加硒量15.30 mg/kg，加硒時(shí)間6.64 h。在此條件下，富硒益生菌產(chǎn)品得率為498.46 mg/kg，硒含量為13 039.62 mg/kg。通過檢驗(yàn)試驗(yàn)，證明該優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。