脂溶性迷迭香提取物微膠囊的制備及其抗氧化性研究

邵爽，顏碩，李朝杰，鮑小根，張秀蘋，谷大海

1.云南農業大學食品科學技術學院（昆明 650000）；2.山東聚鴻生物科技研究院有限公司（威海 264200）；3.尋甸縣伊泰食品有限公司（昆明 650000）

亞灌木芳香植物迷迭香（Rosmarinus of ficinalis L.）原產于歐洲地區及非洲地中海沿岸，其生物活性豐富，常被用作藥材及烹飪原料進行使用[1-2]。在模擬動物細胞環境的體外試驗中發現，迷迭香的多酚提取物可使癌細胞內的ROS含量急劇增加，使其逐漸死亡，最終由于無法增殖而停止擴散[3]。脂溶性迷迭香提取物，其主要活性物質為鼠尾草酸和鼠尾草酚，主要通過中斷自由基鏈式反應，清除自由基以起到抗氧化的作用[4]，其抗氧化效果較好[5-8]。迷迭香來源天然、安全無毒、穩定性好且無不良反應[9]。呂雯雯等[4]向新鮮豬肉中添加脂溶性迷迭香提取物，結果發現它不僅能有效減緩豬肉脂肪的氧化，還能防止豬肉pH的降低，抑制微生物的生長和繁殖，延緩生鮮豬肉的貨架期。霍曉娜等[10]研究表明脂溶性抗氧化劑相比于水溶性抗氧化劑，可以較好抑制豬肉的脂肪氧化和細菌繁殖，從而延長其貨架期。Gordon等[11]發現在80 ℃和100 ℃條件下，迷迭香提取物對菜籽油的保護作用優于丁基羥基茴香醚（BHA）和2,6-二叔丁基對苯酚（BHT）。

微膠囊技術在很多領域得到非常廣泛使用，近年來更是在食品領域受到廣泛青睞。微膠囊技術在食品中的應用主要是對油脂、酶、微生物及果蔬飲料等的包埋[12]。微膠囊具有將流質體粉末化、隔離活性組分、保護敏感的食品組分以及控制定向釋放等功能[13]。天然環糊精及其衍生物具有外親水的剛性空腔結構，可使小分子物質進入空腔內形成主客體包合物，從而提高客體分子的穩定性和水溶性，并控制客體小分子的釋放量[14-15]。羥丙基-β-環糊精（HP-β-CD）是由環糊精與環氧丙烷縮合得到的親水性衍生物，羥丙基破壞環糊精分子內的氫鍵，不僅提高HP-β-CD的水溶性，還保留β-CD的包合能力[16]，應用非常廣泛。其水溶性比β-環糊精更好，常溫下其溶解程度達50%以上，由于性質優良，其在醫藥和食品等領域的應用非常廣泛[17]。楊偉培等[18]利用HP-β-CD對水飛薊素進行包埋，結果發現其在大鼠體內的生物利用度較未包埋組顯著提高。王晴晴等[19]將白藜蘆醇用HP-β-CD包埋成微膠囊，結果發現可以顯著提高白藜蘆醇的溶解度，提高其生物利用價值。此次試驗利用HP-β-CD對脂溶性迷迭香提取物進行包埋，考察微膠囊包埋的最佳條件和微膠囊化對其抗氧化性的影響，旨在為脂溶性抗氧化劑的微膠囊化提供理論依據和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脂溶性迷迭香提取物（食品級，河南森源本草天然產物股份有限公司）；羥丙基-β-環糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD，食品級，河北汪優生物科技有限公司）；福林酚（分析純，北京酷來搏科技有限公司）；無水碳酸鈉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；三氯乙酸（分析純，廣東光華科技股份有限公司）；2-硫代巴比妥酸（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na，分析純，西隴科學股份有限公司）；沒食子酸標準品（HPLC≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）。

L1611030紫外-可見光分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；XHF-D高速分散器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；H2-16KR臺式離心機（河南可成儀器設備有限公司）；ZD-85氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市環宇科學儀器廠）；BS224S分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；JJ500型電子天平[美國雙杰兄弟（集團）有限公司]；Scientz-18N真空冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 微膠囊制備工藝

試驗以HP-β-CD為包合材料，脂溶性迷迭香提取物為芯材制備脂溶性迷迭香提取物微膠囊。配制10%的HP-β-CD溶液，放置8 h備用。加入一定量脂溶性迷迭香提取物，放置在氣浴恒溫振蕩器上振蕩一定的時間。將振蕩后的溶液取出冷卻，在8 000 r/min條件下離心15 min，上清液即為脂溶性迷迭香提取物微膠囊溶液。將上清液通過冷凍干燥，即可獲得脂溶性迷迭香提取物微膠囊。以包埋率為評價指標，考察形成微膠囊的最適條件。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 芯壁比對包埋率的影響

選擇振蕩時間40 min、振蕩溫度45 ℃，以包埋率為評價指標，考察不同芯壁比（1∶13，1∶12，1∶11，1∶10和1∶9）對微膠囊包埋率的影響。

1.2.2.2 振蕩時間對包埋率的影響

選擇芯壁比1∶12、振蕩溫度45 ℃，以包埋率為評價指標，考察不同振蕩時間（20，40，60，80和100 min）對微膠囊包埋率的影響。

1.2.2.3 振蕩溫度對包埋率的影響

選擇芯壁比1∶12、振蕩時間40 min，以包埋率為評價指標，考察不同振蕩溫度（35，40，45，50和55℃）對微膠囊包埋率的影響。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，進行正交試驗設計分析。根據單因素試驗結果，運用Design Expert8.0.6，取芯壁比（脂溶性迷迭香提取物與HP-β-CD比例1∶13，1∶12和1∶11）、振蕩時間（20，40和60 min）、振蕩溫度（40，45和50 ℃）3個因素，設計正交試驗的因素水平，選取L9(33)正交表進行試驗，如表1所示。

表1 L9(33)正交試驗因素水平表

1.2.4 微膠囊包埋率和緩釋率的計算

1.2.4.1 沒食子酸標曲的制作

參照GB/T 31740.2—2015《茶制品第2部分：茶多酚》中多酚含量的測定方法[20]，按照福林酚法測定多酚含量。精密稱取一定量的沒食子酸對照品溶于純水中，將質量濃度分別稀釋成10，20，30，40和50 μg/mL，以純水為空白對照，分別移取測試液各1 mL于刻度試管內，加入5.0 mL 10%福林酚試劑，搖勻，反應3～8 min，加入4.0 mL 7.5%的Na2CO3溶液，搖勻后室溫下放置60 min。在765 nm波長下測定吸光度（A）。作線性回歸，得到標準曲線為y=0.011x+0.011 5，R2=0.999 5。

1.2.4.2 微膠囊包埋率的計算

稱取一定量的脂溶性迷迭香提取物溶于10%HP-β-CD水溶液中，分別測定包埋前溶液中脂溶性迷迭香提取物的含量和包埋后離心上清液中脂溶性迷迭香提取物的含量，按照沒食子酸法測定溶液中的多酚含量，按式（1）計算微膠囊包埋率。

式中：W為微膠囊包埋率，%；A為上清液中脂溶性迷迭香提取物含量，g/mL；B為包埋前脂溶性迷迭香提取物含量，g/mL。

1.2.4.3 微膠囊載物量的計算

分別精密稱取相同質量（精確至0.000 1 g）的脂溶性迷迭香提取物和脂溶性迷迭香提取物微膠囊溶于純水中，按照沒食子酸法測定溶液中的多酚含量，計算微膠囊載物量，按式（2）計算。

式中：S為微膠囊載物量，%；C為微膠囊中脂溶性迷迭香提取物含量，g/mL；D為脂溶性迷迭香提取物含量，g/mL。

1.2.4.4 微膠囊緩釋率的測定

精密稱取0.100 0 g脂溶性迷迭香提取物微膠囊，分散于100 mL超純水中，進行溶出試驗，每隔24 h取0.5 mL溶液。取出的樣品于5 000 r/min離心15 min，取100 μL上清液于試管中，按照沒食子酸法測定脂溶性迷迭香提取物含量，通過測定顯色后的吸光度，計算微膠囊芯材的釋放量，繪制釋放曲線。

1.2.5 脂溶性迷迭香提取物微膠囊抗氧化能力的測定

1.2.5.1 丙二醛標曲的制作

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》[21]，采用分光光度法測定丙二醛含量。準確配制質量濃度分別為0.01，0.05，0.10，0.15和0.25 μg/mL的丙二醛標準溶液，以樣品空白調節零點，于波長352 nm處測定吸光度。作線性回歸，得到標準曲線y=1.164 4x+0.006 2，R2=0.999 1。

1.2.5.2 牛肉處理方法

取新鮮的黃牛后腿肉，加入3%的食鹽絞碎，將肉糜分成A、B、C、D組，每組3份，每份100 g，備用，按照表2添加抗氧化劑。其中A組為空白組，B組為陽性對照組。每份肉樣平鋪于錫箔紙上，放于4 ℃條件下冰箱中腌制，在腌制第1，第4，第7，第10，第13和第16天測定其硫代巴比妥酸值（TBARs），觀察將脂溶性迷迭香提取物微膠囊化對其抗氧化能力的影響。

表2 樣品處理 單位：%

1.2.5.3 牛肉TBARs含量的測定

準確稱取5 g（精確到0.01 g）牛肉樣品置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL三氯乙酸混合液搖勻，加塞密封，置于恒溫振蕩器上50 ℃振搖30 min，取出冷卻至室溫，用雙層定量慢速濾紙過濾，棄去初濾液，續濾液備用。

準確移取5 mL上述濾液，置于25 mL具塞比色管中，另取5 mL三氯乙酸混合液作為樣品空白，分別加入5 mL硫代巴比妥酸（TBA）水溶液，加塞混勻，置于90 ℃水浴內反應30 min，取出冷卻至室溫。以樣品空白調節零點，于波長352 nm處測定吸光度。

1.3 數據處理

所有數據均采用Excel 2010軟件進行數據初步處理分析，所有樣品均做3次平行，采用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析對各組進行One-Way ANOVA方差分析和Duncan’s多重比較，P＜0.05水平做顯著差異檢驗的標準；用SIMCA 14.1（瑞典Umetrics AB公司）進行多元統計學分析，采用Origin 2017進行繪圖。

2 結果分析

2.1 脂溶性迷迭香提取物微膠囊單因素試驗結果

2.1.1 脂溶性迷迭香提取物與HP-β-CD的比例對包埋率的影響

試驗結果如圖1所示。一開始隨著脂溶性迷迭香提取物用量的增加，微膠囊包埋率呈現上升的趨勢。脂溶性迷迭香提取物與HP-β-CD比例1∶12時，包埋率最高，當兩者比例超過1∶12時，微膠囊的包埋率開始下降。因此選擇芯壁比1∶12進行后續的正交試驗。

圖1 迷迭香提取物與羥丙基-β-環糊精的比例對包埋率的影響

2.1.2 振蕩時間對包埋率的影響

試驗結果如圖2所示。一開始隨著振蕩時間的增加，包埋率也隨之增加。振蕩時間40 min時，包埋率達到最大。隨著振蕩時間繼續延長，包埋率又隨著時間的增加而降低。因此選擇振蕩時間40 min進行后續的正交試驗。

圖2 振蕩時間對包埋率的影響

2.1.3 振蕩溫度對包埋率的影響

試驗結果如圖3所示。溫度在35～45 ℃范圍內時，脂溶性迷迭香提取物微膠囊的包埋率隨著溫度的升高而升高，溫度達到45 ℃時，包埋率達到最高，而后包埋率隨著溫度的升高而降低。因此選擇振蕩溫度45 ℃進行后續的正交試驗。

圖3 振蕩溫度對包埋率的影響

2.2 正交試驗結果

基于單因素試驗中影響脂溶性迷迭香提取物微膠囊形成的因素，選取芯壁比、振蕩時間、振蕩溫度這3個因素分別作為正交試驗的A、B、C這3個因素。采用正交試驗進行三因素三水平試驗，以包埋率為最終評價指標，試驗結果見表3。

表3 迷迭香提取物微膠囊正交試驗結果

利用Excel 2019、Design Expert 8.0.6進行數據處理，在P＜0.05和P＜0.01水平下進行檢測。從表3可以看出，制備迷迭香提取物微膠囊的最優組合為A1B3C3，即芯壁比1∶13，振蕩時間60 min，振蕩溫度50 ℃。根據極差結果分析得到RC＞RB＞RA，因此影響包埋率因素的主次順序為振蕩溫度＞振蕩時間＞芯壁比。振蕩溫度對微膠囊的包埋率影響最大，溫度50 ℃時，包埋效果最好；其次是振蕩時間，時間為40 min時，包埋效果最佳；最后是迷迭香提取物與HP-β-CD的比例，方差分析結果如表4所示。

表4 方差分析表

由表4結果直觀分析可見，3個因素對脂溶性迷迭香提取物微膠囊包埋率 的影響程度依次為C＞B＞A。方差分析表明，因素C影響最為顯著，其次是因素B，差異有統計學意義（P＜0.05）。因素A對試驗影響較小（P＞0.05）。

2.3 驗證試驗

為確認上述工藝的穩定性，按照表4極差分析結果，選取芯壁比1∶13、振蕩時間60 min、振蕩溫度50℃進行驗證試驗，重復測定3次。測得微膠囊的包埋率如表5所示。

表5 驗證試驗結果

由表5所示，當芯壁比1∶13、振蕩時間60 min、振蕩溫度50 ℃時，微膠囊包埋率為97.48%±0.74%。試驗結果表明，該工藝穩定可行，并且重復性良好。楊玉婷等[22]以HP-β-CD壁材對川芎揮發油進行包埋，結果發現川芎揮發油的溶解度得到顯著提高，而且在60 ℃下貯藏10 d，包合物表現出良好穩定性，該方法操作簡單、包埋率高，能顯著改善川芎揮發油的溶解度及穩定性。范珊珊等[23]利用HP-β-CD對氯雷他定進行包埋，包埋率為97.67%。付麗娜等[24]將茉莉精油制成微膠囊后，其水溶性大幅提高，同時也保護其貯存及使用過程中活性，提高精油的穩定性。相關結論皆與試驗結果一致。

2.4 微膠囊載物量測定結果

采用紫外-可見分光光度法，通過脂溶性迷迭香提取物在紫外-可見光區的特定波長光的吸收度，對其進行定性和定量分析。分別測定脂溶性迷迭香提取物包埋前后的吸光度，微膠囊的載物量為7.50%±0.89%。蘇行等[25]利用HP-β-CD對丹參二萜醌進行包埋，其載藥量為5.44%。王天琦[26]通過冷凍干燥法制備檸檬醛/羥丙基-β-環糊精包合物，其含油率為5.9%，皆與試驗結果相近。

2.5 微膠囊緩釋率測定結果

采用紫外-可見分光光度法，通過脂溶性迷迭香提取物在紫外-可見光區的特定波長光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析。每隔24 h測定脂溶性迷迭香提取物微膠囊的緩釋率。脂溶性迷迭香提取物微膠囊在第0天時，緩釋率為74.21%，隨著時間的延長，微膠囊的緩釋率逐漸升高，到第4天時，緩釋率達95.68%。可能是微膠囊在高負載狀態下，釋放率呈現顯著上升趨勢[27]。其緩釋率如圖4所示。說明將脂溶性迷迭香提取物微膠囊化可以起到一定緩釋作用，并且可以很好地保護迷迭香提取物的活性。Julaeha等[28]研究發現微膠囊可以提高活性物質的穩定性，調節其釋放速率，從而延長產品的保質期，表明微膠囊具有一定緩釋作用。

圖4 迷迭香提取物微膠囊緩釋率曲線

2.6 牛肉糜腌制過程中TBARs值測定結果

從表6可以看出，在腌制過程中，4組均維持在良質肉的水平，其中空白組在腌制過程中氧化最嚴重，TBARs值顯著高于其他組（P＜0.05），說明異VC鈉、脂溶性迷迭香提取物和脂溶性迷迭香提取物微膠囊能夠很好地抑制脂肪氧化。在腌制第1天，B、C、D組的TBARs值沒有顯著性差異（P＞0.05）。說明在腌制第1天，脂溶性迷迭香提取物、脂溶性迷迭香提取物微膠囊和異VC鈉的抗氧化效果相當。在腌制第4天，B組TBARs值顯著低于C、D組（P＜0.05），C、D組之間沒有顯著性差異。說明在腌制初期，脂溶性迷迭香提取物和脂溶性迷迭香提取物微膠囊的抗氧化效果相當。

表6 牛肉糜腌制過程中TBARs值的變化

在腌制第7～第13天，B、D組的TBARs值沒有顯著性差異，但顯著低于C組（P＜0.05），在腌制第16天，D組TBARs值顯著低于B、C組。綜合試驗結果說明將脂溶性迷迭香提取物微膠囊化可以明顯提高其抗氧化能力，還能起到一定緩釋作用。Christaki等[29]將精油微膠囊添加到奶酪中，結果發現其可以有效控制奶酪的水分和質量損失，延長奶酪的保質期，與此次試驗結論一致。

3 結論

試驗探究不同芯壁比、振蕩時間及振蕩溫度對微膠囊包埋效果的影響。結果表明，當芯壁比1∶13、振蕩時間60 min、振蕩溫度50 ℃時，脂溶性迷迭香提取物微膠囊的包埋效果最佳，包埋率達97.48%，載物量為7.50%。另外，脂溶性迷迭香提取物微膠囊后期的抗氧化能力顯著高于脂溶性迷迭香提取物（P＜0.05），說明將其微膠囊化可以保護脂溶性迷迭香提取物的活性，還有一定緩釋作用，為進一步研究天然抗氧化劑的微膠囊化提供理論依據。