黑蒜桑葚復合口服液工藝優化及其抗氧化活性研究

懷欲曉，李文璇，邢佳琦，唐百川，盧曉明,2

1.山東農業大學 食品科學與工程學院（泰安 271018）；2.山東省高等學校食品營養與健康重點實驗室（泰安 271018）

黑蒜是大蒜經高溫、高濕處理一定時間后得到的產品，具有獨特的口感，無辛辣刺激味道，口感軟糯酸甜，深受人們喜歡[1]。與新鮮大蒜相比，發酵后的黑蒜多酚、多糖含量及抗氧化能力均較高[2]，富含沒食子酸、p-香豆酸、槲皮素、兒茶素及表兒茶素等多酚類化合物[3]，具有較高的鐵離子還原能力、清除DPPH·、ABTS+、OH和超氧陰離子自由基的抗氧化活性[4-5]，以及抗炎、抗癌及預防肥胖等多種生理活性[6]，已經成為公認的天然保健食品，開發和應用前景十分廣闊[7-13]。

黑桑葚又稱為桑棗、桑果、桑椹，色澤誘人，酸甜多汁，風味較獨特[14]。桑葚中除了含有機酸、維生素、氨基酸等營養物質外[15-16]，還富含酚類和花色苷等多種功能成分[17]。研究表明，桑葚能有效地清除自由基[18]，具有抗腫瘤[19]、降血糖[20]、降血脂[21]等多種功能。目前，桑葚因其良好的口感、豐富的營養物質和對人體的健康功效使得其精深加工產品的市場需求量激增，備受關注。

此研究以黑蒜和桑葚為原料，羧甲基纖維素鈉為穩定劑，通過添加一定量的赤蘚糖醇、薄荷醇和檸檬酸進行調味制得黑蒜桑葚復合口服液，并與抗壞血酸進行對比，以DPPH自由基、羥自由基、ABTS+自由基清除能力等指標評價其抗氧化活性[22-23]，以期為黑蒜桑葚復合口服液的開發提供理論依據和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

獨頭黑蒜（濟南康澤生物科技有限公司）；桑葚（泰安農貿市場）。

1.2 試劑

沒食子酸（分析純，天津市百世化工有限公司）；福林酚（分析純，北京索萊寶科技有限公司）；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基、2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（分析純，梯希愛化成工業發展有限公司）；過硫酸鉀、水楊酸、硫酸亞鐵、無水乙醇、碳酸鈉、H2O2溶液（分析純，天津市凱通化學試劑有限公司）；抗壞血酸（分析純，天津市風船化學試劑材料科技有限公司）；赤蘚糖醇、薄荷醇、檸檬酸（食品級，河南萬邦實業有限公司）；羧甲基纖維素鈉（食品級，億鑫生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器與設備

HH-S4數顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；FSJ-A03D1粉碎機（小熊電器股份有限公司）；CN-LPC6002電子秤（昆山優科維特電子科技有限公司）；Lambda 365紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；pH計（奧豪斯儀器有限公司）；PAL-1糖度計（ATAGO）。

1.4 試驗方法

1.4.1 黑蒜桑葚復合口服液的制備

流程圖如圖1所示。

圖1 黑蒜桑葚復合口服液流程圖

1.4.2 原料處理

黑蒜汁制備：黑蒜去皮清洗，按照1∶6（g/mL）的比例與水混合破碎，在60 ℃水浴浸提20 min，冷卻后過濾，在4 000 r/min下離心10 min，取上清液。

桑葚汁制備：桑葚用5%的食鹽溶液浸泡清洗5 min，按照1∶3（g/mL）的比例與水混合進行榨汁并過濾，在4 000 r/min下離心10 min，取上清液。

1.4.3 復合口服液工藝條件的確定

1.4.3.1 單因素試驗

根據預試驗結果，確定黑蒜汁與桑葚汁比例3∶5、羧甲基纖維素鈉添加量0.60%。以預試驗為基礎，優化赤蘚糖醇添加量、薄荷醇添加量和檸檬酸添加量的最佳配比。

因素設計：赤蘚糖醇添加量分別為1.00%，1.50%，2.00%，2.50%和3.00%；薄荷醇添加量分別為0.25%，0.50%，0.75%，1.00%和1.25%；檸檬酸添加量分別為0.40%，0.50%，0.60%，0.70%和0.80%。考察以上3個因素對桑葚黑蒜復合口服液工藝的影響，并結合感官評分確定單因素的最佳條件。

1.4.3.2 響應面優化試驗設計

在單因素試驗基礎上，通過Design-Expert軟件，以模糊感官評分為響應值，設計三因素三水平響應面試驗，得到復合口服液的最優工藝條件。因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平 單位：%

1.4.4 感官評價標準

黑蒜桑葚復合口服液的評價采用感官綜合評分法，參照GB 7101—2022《食品安全國家標準飲料》[24]進行評價，制定出評價標準。由10同學組成感官品評小組，主要對復合口服液的組織狀態、滋味、氣味和口感4個方面進行評定。評定每一個樣品后，清水漱口評定下一個樣品。評價標準如表2所示。

表2 黑蒜桑葚復合口服液感官評價標準

1.4.5 模糊數學評價模型的建立

1.4.5.1 因素集的建立

以組織狀態、滋味、氣味和口感組成評價因素集，即U={組織狀態，滋味，氣味，口感}。

1.4.5.2 評語集的建立

以優（V1）、良（V2）、中（V3）、差（V4）組成每個因素的評語集，即V={優，良，中，差}。

1.4.5.3 評價權重集的確定

將評價因素組織狀態、滋味、氣味和口感分別賦予權重系數0.20，0.25，0.25和0.30，即W={0.20，0.25，0.25，0.30}。

1.4.5.4 模糊關系綜合評判集的確定

參考李夢倩等[25]方法，采用模糊數學評價法對黑蒜桑葚復合口服液感官綜合評價進行評定。對10名感官評價人員模糊數學評價各因素投票數統計，每組樣品的評價結果L=（權重矩陣M×模糊矩陣T），得到模糊評價矩陣T1～T17。分別賦予優、良、中、差分值為90，80，70和60分，將L中的各個量分別與相應分值相乘再相加即可得感官評分。

1.4.6 理化指標的測定

1.4.6.1 pH測定

采用pH計測定pH。

1.4.6.2 可溶性固形物含量測定

采用糖度計測定可溶性固形物含量。

1.4.6.3 總酚含量測定

總酚含量采用Folin-Ciocalteu法[26-27]測定。以含量（μg）對吸光度進行線性回歸，得回歸方程y=0.028 7x+0.020 5，線性關系R2=0.999 2，線性范圍10～60 μg。結果以沒食子酸當量（gallic acid equivalents，GAE）表示，單位μg GAE/mL。

1.4.7 抗氧化活性研究

1.4.7.1 DPPH自由基清除率的測定

取2 mL復合口服液于10 mL離心管中，與2 mL DPPH溶液混勻，避光放置30 min后，以乙醇為空白對照，于波長517 nm下測定吸光度A1；同時測定2 mL復合口服液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度A2，及2 mL無水乙醇與2 mL DPPH溶液混合后的吸光度A0；以VC作為陽性對照。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

式中：A1為波長517 nm下測定的吸光度，L/（g·cm）；A2為2 mL復合口服液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度，L/（g·cm）；A0為2 mL無水乙醇與2 mL DPPH溶液混合后的吸光度，L/（g·cm）。

1.4.7.2 羥自由基清除率的測定

加入1 mL FeSO4溶液和1 mL H2O2溶液于10 mL離心管中混勻，依次加入1 mL乙醇-水楊酸溶、1 mL復合口服液及1 mL去離子水，混勻后于37 ℃水浴避光放置15 min后，于波長510 nm處測定吸光度A1。同樣方法測定以1 mL去離子水代替H2O2溶液的吸光度A2，及以1 mL去離子水代替待測液的吸光度A0。其中，A0以不加H2O2體系為參比，A1和A2以純水為參比，VC作為陽性對照。按式（2）計算羥自由基清除率[28-29]。

式中：A1為波長510 nm下測定的吸光度，L/（g·cm）；A2為以1 mL去離子水代替H2O2溶液的吸光度，L/（g·cm）；A0為以1 mL去離子水代替待測液的吸光度，L/（g·cm）。

1.4.7.3 ABTS+自由基清除率的測定

取4.8 mL ABTS+自由基稀釋液，加入0.2 mL復合口服液并混勻，室溫下避光反應15 min，以無水乙醇為參比，于波長734 nm處測定吸光度A1。以0.2 mL無水乙醇代替待測液作空白對照，測定吸光度A0，VC陽性對照。ABTS+清除率按式（3）計算。

式中：A1為波長734 nm下測定的吸光度，L/（g·cm）；A0為0.2 mL無水乙醇代替待測液作空白對照測定的吸光度，L/（g·cm）。

1.4.8 數據統計

每組試驗平行測定3次，采用Design-Expert 11.0和IBM SPSS 27處理分析試驗數據，0rigin 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 赤蘚糖醇添加量的確定

從圖2可以發現，赤蘚糖醇添加量為1.00%～2.00%時，感官評分逐漸升高，高于2.00%時感官評分呈現降低趨勢。當赤蘚糖醇添加量＜2.00%時，口服液甜度不足，添加量＞2.00%時口服液過于甜膩，掩蓋了其本身原材料的滋味。在赤蘚糖醇添加量為2.00%時，感官評分最高，甜度適口，風味獨特，因此赤蘚糖醇添加量選擇2.00%。

圖2 赤蘚糖醇添加量對口服液的感官評分的影響

2.1.2 薄荷醇添加量的確定

從圖3可以看出，薄荷醇添加量為0.10%～0.15%時，感官評分逐漸上升，0.15%以上感官評分逐漸降低。當薄荷醇添加量＜0.15%時，感官評分稍低，添加量＞0.15%時具有較強的薄荷清涼感，產生苦澀味，掩蓋了桑葚黑蒜原有的風味，因此薄荷醇添加量選擇0.15%。

圖3 薄荷醇添加量對感官評分的影響

2.1.3 檸檬酸添加量的確定

從圖4可以看出，隨著檸檬酸添加量的增加，感官評分呈現先逐漸升高后降低的趨勢。當添加量為0.60%時，感官評分最高。當檸檬酸添加量＜0.60%時，飲料酸味不足，不夠爽口；添加量＞0.60%酸味過重。因此檸檬酸添加量選擇0.60%。

圖4 檸檬酸添加量對感官評分的影響

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面設計及方差分析

選擇赤蘚糖醇添加量（A）、薄荷醇添加量（B）和檸檬酸添加量（C）為自變量，感官評價（Y）為因變量進行響應面試驗。響應面試驗結果如表3所示，方差分析結果如表4所示。

表3 響應面試驗設計與結果

表4 回歸系數方差分析結果

利用Design-Expert 11.0軟件對表3中的試驗數據進行分析，得到二次多項回歸方程：感官評分=88.83+0.273 7A+2.05B-2.92C-0.462 5AB-0.350 0AC+0.662 5BC-2.50A2-3.66B2-4.582C2。

由表4可知，感官評分模型F值=264.76，P＜0.000 1，表明該試驗所用數學模型極顯著，具有統計學意義，失擬項為0.247 2（P＞0.05），為不顯著，表明模型的預測結果良好，預測值與實際值接近，可用于預測黑蒜桑葚復合口服液的最佳配方?；貧w方程的預測值之間的相關系數模型的R2=0.997 1，Radj2=0.993 3，表明試驗數據可用模型進行相關解釋，方程的可靠性較高。變異系數（C.V.）為0.994 9%，較小，方程模型具有良好的擬合性。一次項B、C及二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），根據F值可知，各因素對試驗結果影響的先后順序為B＞C＞A，即薄荷醇添加量＞檸檬酸添加量＞赤蘚糖醇添加量。

2.2.2 各因素的交互作用分析

響應面反映了各因素之間交互作用的強弱，響應面傾斜度越高，表明各因素之間的交互作用越顯著[30]。從圖5可以看出，赤蘚糖醇添加量、薄荷醇添加量、檸檬酸添加量的交互作用對復合口服液感官評分影響的響應面坡度均相對陡峭，表明赤蘚糖醇添加量、薄荷醇添加量、檸檬酸添加量之間的交互作用對感官評分均有影響，且薄荷醇添加量和檸檬酸添加量的交互作用坡度傾斜度較高，交互作用較大。響應面圖中的最高點存在響應值極值，表明黑蒜桑葚復合口服液的感官評分具有極大值。

圖5 兩因素交互作用對黑蒜桑葚復合口服液感官評分影響的響應面

為進一步確定最佳工藝條件，結合各因素間交互作用對感官評分的影響并以最高感官評分為優化目標，根據Design-Expert 11.0軟件運行結果，得到最佳工藝條件：赤蘚糖醇添加量1.98%，薄荷醇添加量0.14%，檸檬酸添加量0.61%，在此條件下模型預測感官評分為88.85分。

2.3 黑蒜桑葚復合口服液最佳配方驗證

為了便于操作，在黑蒜汁和桑葚汁比例3∶5、羧甲基纖維素鈉添加量0.60%的條件下，選擇赤蘚糖醇添加量2.00%、薄荷醇添加量0.15%、檸檬酸添加量0.60%進行3次重復試驗驗證，平均感官評分為88.24±0.35，與模型預測結果88.85接近，表明該模型與實際試驗結果擬合度較好，具有一定可行性。

2.4 理化指標測定結果

測定最佳工藝條件下獲得的黑蒜桑葚復合口服液的理化指標，結果顯示可溶性固形物含量10.00%，pH 3.12，總酚含量17.83 μg GAE/mL。

2.5 抗氧化活性研究與分析

如表5所示，與抗壞血酸相比，復合口服液DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、ATBS+自由基清除率略低，分別為90.05%，57.14%和87.64%，表明該口服液具有一定的抗氧化效果。

表5 黑蒜桑葚復合口服液抗氧化活性成分和自由基清除能力檢測結果 單位：%

3 結論

此試驗以黑蒜和桑葚為主要原料，在單因素試驗的基礎上，采用模糊數學綜合評價法結合響應面試驗優化法獲得黑蒜桑葚復合口服液的最佳工藝條件。最佳工藝條件為黑蒜汁和桑葚汁比例3∶5，羧甲基纖維素鈉添加量0.60%，赤蘚糖醇添加量2.00%，薄荷醇添加量0.15%，檸檬酸添加量為0.60%。在最佳工藝條件下，感官評分為88.24分，產品pH為3.12，可溶性固形物含量為10.00%，總酚含量為17.83 μg GAE/mL，DPPH自由基清除率為90.05%，羥自由基清除率為57.14%，ATBS+自由基清除率為87.64%。黑蒜桑葚復合口服液色澤均勻，呈深紫紅色，澄清透明，無分層現象，酸甜爽口，具有獨特的黑蒜和桑葚風味和較高的抗氧化活性。此研究為黑蒜和桑葚多元化產品的研發提供了理論依據。