腐乳混合發酵劑配方優化

楊潤，任淑娣，陳中愛，劉麗靜，許家威，胡永金

云南農業大學食品科學技術學院（昆明 650201）

腐乳是我國一種具有悠長歷史的大豆蛋白發酵食品。其具有風味獨特、營養豐富、易保存的特點[1-2]，在中國及東南亞地區深受人們喜愛[3]，常作為佐餐食品呈現于人們餐桌[4]，因其制作方法和質地口感類似奶酪，在歐美，許多人把它稱作中國干酪[5]。腐乳中不僅包含了大豆自身的各種活性物質，還經過微生物發酵作用去除了大豆苦腥味、脹氣因子和抗營養因子，生產出各種有香氣的有機酸、醇類、酯類和氨基酸[6]，以及硫胺素、尼克酸、鈣和磷等營養成分[7]，具有降血壓、降低血液中的膽固醇[8-10]、抗氧化[11]及保護人體神經系統[12-13]等功能。另外，在腐乳加工過程中還會產生人體必需的VB12[14]。腐乳發酵過程涉及多種微生物，其主要制曲菌種為雅致放射毛霉、總狀毛霉、五通橋毛霉及高大毛霉[15]。毛霉能分泌多種酶，將大豆中的蛋白質、脂質和碳水化合物水解成氨基酸和小分子，對品質形成有重要貢獻，是主要的腐乳發酵菌種[16]。

傳統發酵腐乳生產是一種開放式的過程，未經過加熱殺菌，因此存在被環境微生物（例如蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等）[17]和其他雜菌污染的風險。另外，腐乳產品中還含有較多的蛋白質及氨基酸，這些物質容易使細菌產生耐藥性并對人體健康造成威脅。目前我國腐乳產業生產主要是利用單一菌種發酵，但采用單一菌種或自然發酵，存在酶系不全、腐乳風味單調等問題[18-19]。基于上述原因，此研究從風味良好的自然發酵腐乳中篩選出蛋白酶活力較強的菌種進行混菌發酵并研制發酵劑，既能保留其固有風味，又能使產品發酵更為穩定，是一種傳統發酵產品升級的有效途徑[20]，為廣大消費者消除食品安全問題的同時為該產業大規模生產提供技術支持和品質保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豆腐、豆腐干粉（新鮮豆腐烘干打碎，市售）；毛霉M-T、毛霉40899、M-7、M-H和M-R（實驗室分離）；干酪素、碳酸氫二鉀、碳酸二氫鉀、三氯乙酸、碳酸鈉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

H2-16KR高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）；SHA-BA恒溫振蕩器（常州澳華儀器有限公司）；LDZX-5OKBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安有限公司）；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；BSC-250恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；HWS24恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；PHS-3CPH計（儀電科學儀器有限公司）；熱板IT-09A5磁力攪拌器（上海一恒科學儀器有限公司）；EX30光學顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）。

1.3 測定方法

1.3.1 微生物的測定

菌落總數測定參照GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》[21]進行測定。

1.3.2 理化指標的測定

水分含量測定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》[22]直接干燥法進行測定；總酸測定參照GB 12456—2021《食品中總酸度測定》[23]pH計電位滴定法進行測定；氨基酸態氮含量測定參照GB 5009.235—2016《氨基酸態氮測定》[24]酸度計法進行測定。

1.4 蛋白酶活力的測定

蛋白酶活力的測定參考潘進權[25]的方法。

1.5 發酵劑制作工藝

配制培養料→滅菌→接種菌種→培養→干制→粉碎→檢驗→成品

培養料：25 g豆腐干粉和水混合，置于150 mL三角瓶中。

水分pH：用乳酸調節pH至指定值。

滅菌：121 ℃下滅菌20 min，趁熱搖散。

接種菌種：接入1×106CFU/g的菌懸液。

培養：于28 ℃培養72 h。

干制：培養完后于50 ℃烘制18 h。

檢驗：檢測發酵劑中霉菌的含量。

1.6 單因素試驗設計

試驗選擇水分添加量（90%，100%，110%，120%和130%）、水分pH（pH 2.5，3，3.5，4和4.5）、菌液添加量（2%，3%，4%，5%和6%）以及菌種比例（3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3）按照工藝流程進行單因素試驗，以發酵劑的霉菌總數為指標對工藝進行分析。

1.7 響應面試驗設計

通過單因素試驗，選出影響腐乳發酵劑霉菌量最大的三個因素，基于此，采用Box-Behnken設計，并以霉菌數量作為反應指標，詳見表1。

表1 響應面試驗參數的因素與編碼水平

1.8 發酵劑發酵特性檢測

針對響應面優化后得出的結果，進行腐乳發酵實驗，檢測發酵劑發酵腐乳的性能，對接種發酵劑后72 h內（每隔12 h）蛋白酶活力、毛坯的總酸以及氨基酸態氮進行測定。

1.9 數據分析統計方法

運用IBM SPSS Statistics 19進行差異性顯著分析，并采用Origin Pro 2018軟件來繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 發酵菌種的選擇

在腐乳發酵過程中，童佳[26]認為蛋白酶是醬油風味形成的關鍵酶，它將大豆中的蛋白質降解為氨基酸、多肽[27]等，對風味及滋味有重要作用。陳怡等[28]將蛋白酶活力作為選擇瀏陽豆豉發酵菌株的重要指標。選擇蛋白酶活力高的菌株，對提高發酵豆制品風味有重要意義。通過對實驗室現有的5株腐乳發酵用霉菌進行蛋白酶活力比較，結果如表2所示。M-T和M-40899在72 h內蛋白酶活力最高，因此選定M-T和M-40899為發酵劑的菌株。通過對發酵劑水分添加量、pH、菌液接種量以及菌種的比例來優化發酵劑的配方。

表2 菌種蛋白酶活力的比較 單位：μg/mL

表3 發酵劑條件響應面設計結果

2.2 腐乳發酵劑影響因素研究

2.2.1 水分添加量對發酵劑霉菌數的影響

水分添加量對腐乳發酵劑霉菌數的影響見圖1。由圖1可知，隨著水分添加量的增加，霉菌數先增加后下降。由于水分含量的增長，腐乳濕度增大，霉菌的生長條件受到一定的影響，水分含量過大則會使其生長速度也受到限制，導致菌落計數隨水分的增加而逐漸減少[29]。水分添加量在110%時霉菌數最高，為8.26 lg CFU/g。這是由于霉菌的生長需要適宜的水分，而110%的添加量使得發酵劑初期的含水量在70%左右，滿足霉菌的生長需求，所以水分添加量選擇110%。

2.2.2 pH對發酵劑霉菌數的影響

pH的變化對腐乳發酵劑霉菌數的影響見圖2。由圖2可知，腐乳發酵劑霉菌數隨著水分pH的增加呈現出先上升后下降的趨勢，在pH為3.5時霉菌生長最旺盛，數量達到最高，為8.31 lg CFU/g。微生物的繁衍需要適宜的pH范圍，而大多數在7.0左右，但霉菌的范圍比較廣，在酸性條件下也能生存，還能抑制其他雜菌的生長[30]，同時由于傳統腐乳發酵前期pH偏向于酸性，因此用乳酸把發酵劑所添加的水分pH分別調成2.5，3.0，3.5，4.0以及4.5，探究不同pH下霉菌的生長情況。

圖2 pH對發酵劑霉菌數的影響

2.2.3 菌種比例對發酵劑霉菌數的影響

菌種比例的變化對腐乳發酵劑霉菌數的影響見圖3。由圖3可知，M-T毛霉和40899霉菌的比例影響著發酵劑的霉菌數。當霉菌40899添加量不變時，霉菌數隨著毛霉M-T數量的減少呈先增加后減少的趨勢；當毛霉M-T添加量不變時，霉菌數隨著毛霉40899數量的增加而減少。當菌種比例為2∶1時，霉菌數最高，為8.27 log CFU/g。不同的霉菌發酵腐乳都會造成產品的風味和可接受度方面的差異[31]，且單一菌種發酵腐乳會因為酶系單一的原因導致風味口感不佳，所以借助雙菌種來發酵腐乳能對腐乳風味以及品質有一個提升。

圖3 菌種比例對發酵劑霉菌數的影響

2.2.4 菌種添加量對發酵劑霉菌數的影響

菌種添加量的變化對腐乳發酵劑霉菌數的影響見圖4。由圖4可知，隨著菌液的添加量的增加，霉菌數呈現先上升后下降的趨勢，但總體變化不大，菌液添加量為4%時霉菌數最高，為8.26 log CFU/g。

圖4 菌液添加量對發酵劑霉菌數的影響

2.2.5 響應面因素及水平的確定

由圖5可知，菌液添加量的變化對于發酵劑的霉菌數的影響小于水分添加量、pH和菌種比例，且發酵劑霉菌數隨菌液添加量的變化波動不大，因此以質量的4%確定添加量。同時以水分添加量、pH和菌液比例三個因素的三個水平設計響應面試驗。

圖5 單因素的組間標準差比較

2.3 發酵劑配方的響應面優化

利用Design-Erpert 8.0軟件對數據進行擬合分析，以霉菌數為因變量，以水分添加量（A）、pH（B）和菌種比例（C）為自變量得到的回歸方程為霉菌總數=8.27+0.025A-0.05B-0.13C+0.025AB-5.0×103AC+0.06BC-0.071A2-0.081B2-0.11C2。

回歸方程分析結果見表4。

表4 發酵劑回歸模型方差分析表

由表4的方差分析數據可知，應用Design-Expert 8.0軟件得到的數據模型是極顯著的（P＜0.000 1＜0.01），而失擬項不顯著（P=0.084 8＞0.05），這說明此試驗得到的數據模型的回歸方程擬合度良好，試驗結果可靠。

2.4 響應面結果分析

利用Design-Expert 8.0軟件繪制能反映影響發酵劑霉菌數的3個因素交互作用的三維響應面圖，如圖6至圖8所示。菌種比例和pH對發酵劑霉菌數有顯著影響，而水分添加量和pH與水分添加量和菌種比例對于發酵劑的霉菌數的影響不顯著。每個因素各自的交互作用十分顯著，表明各因素作為試驗控制具有顯著意義，各個因素顯著程度依次為菌液比例＞pH＞水分添加量。利用Design-Expert 8.0軟件優化分析，確定最佳提取工藝：水分添加量為111%，pH為3.22，菌液比例為0.69，預測值為8.34 lg（CFU/g）。通過驗證試驗，發酵劑成品霉菌數為8.35 lg（CFU/g）。

圖6 水分添加量與pH對霉菌總數影響的響應面及等高線圖

圖7 水分添加量與菌種比例對霉菌總數影響的響應面及等高線圖

圖8 pH與菌種比例對霉菌總數影響的響應面及等高線圖

2.5 發酵劑發酵腐乳性能的探究

根據響應面結果分析優化之后發酵劑的配方按照發酵劑制作工藝步驟制備腐乳雙菌種發酵劑，并用得到的發酵劑發酵腐乳，發酵情況如圖9所示，同時測定發酵72 h內蛋白酶活力、總酸以及氨基酸態氮的變化，以檢測發酵劑的發酵性能。

圖9 發酵劑發酵腐乳的毛霉生長情況

2.6 蛋白酶活力、總酸及氨基酸態氮隨時間的變化

通過測定腐乳發酵過程中的蛋白酶活力，可以反映腐乳的發酵狀態[32]。酶活力越旺盛，則腐乳的蛋白質降解得就越快。如圖10所示，發酵劑培養的毛坯在72 h時蛋白酶活力能達到37.25 μg/g。

圖10 蛋白酶活力、總酸及氨基酸態氮隨時間的變化

腐乳在發酵過程中會產生有機酸、游離脂肪酸、游離氨基酸等物質，是腐乳酸度形成的主要因素[33]。由圖10可知，在腐乳發酵劑下，總酸在72 h發酵過程中處于上升狀態。在前發酵過程中，總酸的來源是乳酸菌代謝生產乳酸、醋酸、琥珀酸等有機酸[34]，對總酸的形成起著非常大的作用。與傳統腐乳前發酵時期的總酸含量對比，發酵劑發酵的腐乳總酸含量上升得稍快，是因為發酵劑含有兩種毛霉，復合發酵使得酶活力更高、所引起的大分子物質降解更快、更多。

氨基酸態氮是腐乳發酵的判斷指標。由圖10可知，發酵劑發酵腐乳的游離氨基酸態氮含量也上升明顯，蛋白質在酶作用下不斷地降解產生氨基酸，導致氨基酸態氮含量小幅增長，含量由0 h的0.004 g/100 g上升到72 h的0.056 g/100 g。與牟定腐乳不同的是，市售腐乳初始蛋白酶活力略低，但是同時間段上升的幅度遠大于牟定腐乳，而游離氨基酸態氮又被譽為判斷腐乳成熟的指標之一，因此可以說明發酵劑的發酵性能優良。

3 結論

通過響應面優化，得到腐乳發酵劑工藝優化結果，即水分添加量為培養基質的111%，pH為3.22，菌液比例為0.69。此時發酵劑的霉菌數為8.35 lg CFU/g。使用發酵劑發酵腐乳的總酸、氨基酸態氮以及蛋白酶活力變化分別從0 h的0.018 g/100 g，0.004 g/100 g和9.12 μg/mL上升到72 h時的0.142 g/100 g，0.056 g/100 g和37.25 μg/mL，與傳統自然發酵的腐乳同時期總酸和氨基酸含量變化增速更快，說明發酵劑發酵性能好。