筑青生命活素固體飲料對小鼠學習記憶障礙的影響

龔頻，徐珂，馬天有 ，竇建衛(wèi)

1.陜西科技大學食品科學與工程學院（西安 710021）；2.西安交通大學公共衛(wèi)生學院（西安 710065）；3.西安交通大學藥學院（西安 710065）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，其癥狀表現(xiàn)為認知障礙、記憶功能障礙等，嚴重影響患者的生活質量[1]。據(jù)流行病學統(tǒng)計顯示，全球患阿爾茲海默病人數(shù)已超2 700萬人，已成為嚴峻的社會公共衛(wèi)生問題[2]。AD的主要誘因有淀粉樣蛋白、自噬紊亂、神經(jīng)炎癥、Ca2+紊亂、線粒體損傷等[3]。目前，AD的發(fā)病機制尚不清楚，主要有膽堿能損傷假說[4]、β淀粉樣蛋白毒性假說[5]、Tau蛋白假說等[6]。

AD的病理學特征包括受影響的腦區(qū)產(chǎn)生廣泛的氧化應激、膽堿功能障礙、淀粉樣斑塊、神經(jīng)元纖維纏結以及神經(jīng)元丟失等[7]。為尋求有效的防治手段，研究者從不同機制出發(fā)，開發(fā)了不同的體外動物模型，其中腹腔注射東莨菪堿致膽堿能系統(tǒng)功能障礙、氧化應激增加而使學習記憶能力下降的建模方法，因具有操作簡便、經(jīng)濟的優(yōu)點而被廣泛應用[7]。

從中醫(yī)學角度分析AD的發(fā)病機制，AD屬“呆病”“善忘”“癡呆”“健忘”的范疇。因此，AD的病機根本為腎虛，治療上應以補腎為主[8]。此試驗擬利用腹腔注射新技術，構建小鼠學習記憶損傷動物模型，并以小鼠為試驗對象，對其進行干預，研究筑青生命活素固體飲料對小鼠學習記憶能力的改善作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 試驗動物

SPF級c57bl/6雄性小鼠，3月齡，50只，西安交通大學動物中心，飼養(yǎng)于SPF級動物房，12 h光照/黑暗循環(huán)（6：00-18：00），室內(nèi)溫度保持在23±2 ℃，濕度保持在40%～70%，可自由獲取食物和飲水。

1.1.2 主要藥品與試劑

筑青生命活素固體飲料（陜西筑青健康生物醫(yī)藥科技有限公司，生產(chǎn)批號：220910）；東莨菪堿（MCE公司，HY-N0296）；超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD，上海江萊科技有限公司，JL12237）；過氧化氫酶（Catalase，CAT，上海江萊科技有限公司，JL18163）；乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AchE，上海江萊科技有限公司，JL20661）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）測試盒（索萊寶公司，BC0020）；乙酰膽堿（Acetylcholine，Ach）測試盒（南京建成，A105-1）；羥自由基含量試劑盒（上海江萊科技有限公司，JL-T1058）；DPPH試劑盒（南京建成，A153-1）；其他試劑均為分析純級別。

1.2 主要儀器與設備

DV215CD萬分之一分析天平（美國奧豪斯公司）；YLS-3TB跳臺記錄儀（濟南益延科技有限公司）；Smart3.0Morris水迷宮（Panlab）；SPARK全波長酶標儀（上海帝肯實驗器材有限公司）；L5S紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組、給藥與造模

SPF級c57bl/6雄鼠50只，自適應飼喂7 d后，將其隨機分成5組，分別為：空白組（正常飼養(yǎng)）、模型組（生理鹽水0.6 mL）；根據(jù)項目要求按照說明書用量換算后試驗低劑量組（5倍人體推薦劑量，21.45 g生藥/kg）、中劑量組（10倍人體推薦劑量，42.9 g生藥/kg）、高劑量組（20倍人體推薦劑量，85.8 g生藥/kg）。每組10只，連續(xù)灌胃給藥15 d。每隔7 d稱量記錄動物體重調(diào)整給藥劑量。

灌胃試驗結束后第2天進行跳臺試驗的訓練，在訓練前20 min除空白組以外所有動物腹腔注射東莨菪堿2 mg/kg，構建小鼠學習記憶障礙模型[9]。流程圖如圖1所示。

圖1 筑青生命活素固體飲料改善學習記憶試驗流程圖

圖2 筑青對c57bl/6小鼠體重變化的影響

1.3.2 跳臺試驗

先將小鼠置于試驗箱內(nèi)進行3 min的適應性訓練，然后接通試驗箱底部回路5 min，36 V的電壓，對小鼠進行電擊刺激，然后跳到隔離平臺上，排除掉不能跳到平臺上的小鼠。試驗結束后，將其置于絕緣平臺上，進行5 min的連續(xù)觀測，并對其各組小鼠第1次從平臺跳下所需的時間，即跳臺潛伏期（step down latency，SDL）和觀察期內(nèi)跳下平臺的錯誤次數(shù)（error times，ET）進行記錄[10]。在觀測期間，如果試驗動物沒有離開平臺，ET記錄為0，SDL記為觀察時間5 min。分別記錄每組小鼠的潛伏期及錯誤次數(shù)，作為測試期成績，經(jīng)過24 h后進行重測期試驗。在停訓7 d后，采用重測期試驗方法，對小鼠進行消退期試驗。

1.3.3 Morris水迷宮試驗

近日，金鉬股份技術中心科研團隊經(jīng)過技術攻關，成功制備出了外徑8 mm、壁厚0.6 mm、長度達8 m的無縫鉬合金薄壁管，一舉攻克了大長徑比無縫鉬合金薄壁管的關鍵技術。

定向航行試驗：訓練前20 min除空白組以外所有動物腹腔注射東莨菪堿2 mg/kg建立癡呆模型，試驗過程中保持平臺的位置不變，將小鼠面向池壁提示物方向分別從一、二、三、四象限輕輕放入水中，并記錄其尋找平臺的時間，以此為逃避潛伏期。試驗動物上臺10 s后自動停止采集。若在60 s規(guī)定時間內(nèi)未找到平臺，則將逃避潛伏期記作60 s，然后人工引導其上平臺并停留30 s。

空間探索試驗：完成定向航行試驗后，取下平臺，將試驗鼠從目標區(qū)的反方向象限投放到池中，進行自主探索90 s，記錄指定時間內(nèi)完成在原平臺位置上游泳的時間、距離和穿臺次數(shù)等指標[11]。

1.3.4 氧化應激及神經(jīng)遞質相關指標的測定

行為學測試結束后，動物腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，眼球取血，并斷頭取腦組織，于-80 ℃冰箱保存。根據(jù)試劑盒的說明，稱取腦組織并提取組織上清液，對各組小鼠血清與腦組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性，MDA水平及腦組織中乙酰膽堿（Ach）水平、乙酰膽堿酯酶（AchE）活性進行測定。

1.3.5 自由基清除能力測定

按照試劑盒說明書稱取小鼠腦組織提取組織上清，檢測各組小鼠血清與腦組織中DPPH、羥自由基含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

通過SPSS 22.0統(tǒng)計軟件GraphPad對所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)均以均值±相對標準偏差（）表示。應用t檢驗方法對兩組進行成比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 筑青生命活素固體飲料對c57bl/6小鼠動物體重變化的影響

經(jīng)15 d給藥及7 d行為學檢測，在給藥期間空白組小鼠生長情況良好，體重平穩(wěn)增加，模型組和筑青生命活素固體飲料給藥組生長情況與空白組相比無顯著差異；行為學檢測后給藥組體重減少，與模型組相比無統(tǒng)計學差異。結果表明，筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠生長情況良好，體重平穩(wěn)增加，說明筑青生命活素固體飲料對小鼠生長無影響。

2.2 筑青生命活素固體飲料對小鼠跳臺試驗的影響

與空白組相比，測試期模型組跳臺試驗潛伏期明顯縮小，錯誤次數(shù)增加，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），表明東莨菪堿致癡呆小鼠學習記憶能力明顯減退，表現(xiàn)為一定的癡呆癥狀。與模型組相比，筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠潛伏期延長，錯誤次數(shù)減小，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結果見表1。重測期筑青生命活素固體飲料給藥組與模型組相比小鼠潛伏期增加、錯誤次數(shù)減少，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；消退期筑青生命活素固體飲料給藥組與模型組相比小鼠潛伏期，錯誤次數(shù)差異較小無統(tǒng)計學意義。結果見表2。

表1 筑青對測試期小鼠跳臺試驗的影響（n=10，）

表1 筑青對測試期小鼠跳臺試驗的影響（n=10，）

表2 筑青生命活素固體飲料對小鼠重測期及消退期跳臺試驗的影響（n=10，）

表2 筑青生命活素固體飲料對小鼠重測期及消退期跳臺試驗的影響（n=10，）

東莨菪堿可通過阻滯M1型突觸后受體，損害海馬區(qū)的記憶，從而導致記憶獲得障礙[12]。在小鼠跳臺試驗中，筑青生命活素固體飲料給藥組與模型組相比重測期小鼠跳臺試驗的潛伏期延長、錯誤次數(shù)減少；消退期筑青生命活素固體飲料給藥組與模型組相比，潛伏期、錯誤次數(shù)無統(tǒng)計學意義，說明筑青生命活素固體飲料可以改善東莨菪堿所致的癡呆，但這種改善不能長期維持。

2.3 筑青生命活素固體飲料對小鼠空間記憶的影響

1) 在定位航行階段，與空白組相比，模型組在定位航行的4 d里尋找平臺潛伏期時間和總路程均增加，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），表明東莨菪堿致癡呆小鼠模型建立成功。筑青生命活素固體飲料給藥組在第1天與模型組相比尋找平臺潛伏期時間和總路程減少但無統(tǒng)計學差異；筑青生命活素固體飲料中劑量給藥組在第2天與模型組相比尋找平臺潛伏期時間和總路程減少，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；筑青生命活素固體飲料低劑量給藥組在第3天與模型組相比尋找平臺潛伏期時間和總路程減少，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；筑青生命活素固體飲料低、中、高劑量給藥組在第4天與模型組相比尋找平臺潛伏期時間和總路程減少，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結果見表3和表4。

表3 筑青生命活素固體飲料對小鼠Morris水迷宮定向航行逃避潛伏期的影響（n=10，）

表3 筑青生命活素固體飲料對小鼠Morris水迷宮定向航行逃避潛伏期的影響（n=10，）

表4 筑青生命活素固體飲料對小鼠Morris水迷宮定向航行游泳總路程的影響（n=10，）

表4 筑青生命活素固體飲料對小鼠Morris水迷宮定向航行游泳總路程的影響（n=10，）

2) 在空間探索階段與空白組相比，在目標象限區(qū)，模型組的相對游動時間、相對游動距離及穿越平臺次數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，筑青生命活素固體飲料給藥組的小鼠在目標象限區(qū)的相對游動時間、相對游動距離、穿越平臺的次數(shù)均有顯著性差異（P＜0.05）。結果如表5所示。

表5 筑青生命活素固體飲料對小鼠Morris水迷宮空間探索的影響（n=10，）

表5 筑青生命活素固體飲料對小鼠Morris水迷宮空間探索的影響（n=10，）

以上結果可能與筑青生命活素固體飲料中覆盆子具有補腎、化痰祛瘀的作用，從而能夠有效調(diào)節(jié)學習記憶障礙有關。覆盆子的氯仿部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位均可不同程度縮短小鼠的逃避潛伏期，增強小鼠的空間探索能力，并且在一定程度上改善東莨菪堿所致的學習記憶障礙小鼠的學習記憶能力[13-15]。

2.4 筑青生命活素固體飲料對氧化應激指標的影響

與空白組相比，模型組小鼠血清中SOD、CAT含量減少，MDA含量增加，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），表明模型小鼠氧化損傷增加，自由基清除能力減弱。與模型組相比，筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠血清中SOD含量增高，其中高劑量組為6.03±1.59 ng/mL（P＜0.05），中劑量組為5.91±3.12 ng/mL（P＜0.05）；筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠血清中CAT含量增高，其中高劑量組為2 349.51±130.48 pg/mL（P＜0.05）；筑青給藥組小鼠血清中MDA含量減少，無統(tǒng)計學意義。結果如圖3所示。

圖3 筑青生命活素固體飲料對小鼠血清和腦組織中氧化應激指標的影響

與空白組相比，模型組小鼠腦組織中SOD、CAT含量減少，MDA含量增加，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。與模型組相比，筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠腦組織中SOD含量增加，其中高劑量給藥組為12.70±1.53 ng/mL（P＜0.05）；筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠腦組織中CAT含量增加，其中高劑量組為4 538.89±671.82 pg/mL（P＜0.05）；筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠MDA含量減少，其中中劑量組為89.35±24.67 nmol/mL（P＜0.05），高劑量組為86.36±22.42 nmol/mL（P＜0.05）。以上結果說明筑青生命活素固體飲料可以提高機體的抗氧化能力。結果如圖3所示。

氧化應激是在高應激條件刺激下，促氧化劑和抗氧化劑之間處于不平衡的狀態(tài)，導致分子和細胞損傷[16]。氧化應激在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。大腦中脂質含量豐富，同時由于線粒體呼吸鏈耗氧較高，容易受到氧自由基的侵襲[17]。MDA是人體內(nèi)一種重要的脂質過氧化產(chǎn)物，它的水平高低能反映機體內(nèi)的過氧化程度[18]；作為平衡體內(nèi)氧化應激水平的抗氧化系統(tǒng)的重要組成，SOD能有效清除活性氧自由基，過氧化氫酶（CAT）能夠催化過氧化氫分解成氧和水，其水平高低能反映機體清除自由基的能力[19]。結果顯示，筑青生命活素固體飲料作用能夠增加小鼠腦組織和血清中SOD、CAT活性，減少MDA含量，血清和腦組織中羥自由基含量減少，腦組織中DPPH清除能力增強，可能通過筑青生命活素固體飲料配方中的覆盆子發(fā)揮作用，已有研究[20-21]表明覆盆子含有高含量的超氧化物歧化酶和花青素，具有很強的抗氧化能力。

2.5 筑青生命活素固體飲料對神經(jīng)遞質指標的影響

膽堿能系統(tǒng)損傷被認為是AD發(fā)生的重要因素之一[22]。AD患者的臨床表現(xiàn)與其乙酰膽堿水平降低有密切關系[23]。乙酰膽堿（ACh）是生物化學基礎，其含量減少可導致學習記憶功能障礙[24]。AchE是腦內(nèi)與學習記憶相關的重要的酶類之一，可分解突觸間隙的神經(jīng)遞質乙酰膽堿，使乙酰膽堿含量降低；AchE活性增加會導致腦內(nèi)學習記憶活動障礙[25]。黃麗萍等[26]研究發(fā)現(xiàn)覆盆子氯仿部位高、低劑量組，覆盆子乙酸乙酯部位高、低劑量組均能不同程度改善癡呆大鼠學習記憶能力，降低皮層AchE活性，升高乙酰膽堿轉移酶活性。

與空白組相比，模型組小鼠腦組織中Ach含量減少，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。與模型組相比，筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠腦組織中Ach含量增加，其中高劑量組為2.15±0.54（P＜0.01）；模型組與空白組相比和筑青生命活素固體飲料給藥組與模型組相比小鼠腦組織Ach E含量均無統(tǒng)計學差異。表明筑青生命活素固體飲料可通過促進Ach的釋放，發(fā)揮改善學習記憶能力。結果如圖4所示。

圖4 筑青生命活素固體飲料對小鼠腦組織中神經(jīng)遞質指標的影響

2.6 筑青生命活素固體飲料對自由基清除能力的影響

與空白組相比，模型組小鼠血清和腦組織中羥自由基含量增加，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組相比，筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠血清中和腦組織中羥自由基含量減少，其中高劑量減少最多，分別為5.17±0.26和5.52±2.79，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。結果如圖5所示。

圖5 筑青生命活素固體飲料對小鼠自由基清除能力的影響

與空白組相比，模型組小鼠血清和腦組織中DPPH自由基清除能力減弱，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。與模型組相比，筑青生命活素固體飲料給藥組小鼠血清中DPPH自由基清除能力無統(tǒng)計學差異；筑青中、高劑量給藥組小鼠腦組織中DPPH自由基清除能力增加，分別為43.97±5.15和52.32±2.71，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。結果如表5所示。

3 結論

根據(jù)此研究結果可知，筑青生命活素固體飲料對小鼠生長無影響，通過采用腹腔注射東莨菪堿來建立記憶獲得障礙模型，利用小鼠跳臺和Morris水迷宮經(jīng)典方法證明該產(chǎn)品可以改善東莨菪堿所致的癡呆，但這種改善不能長期維持。結果顯示，筑青生命活素固體飲料作用能夠增加小鼠腦組織和血清中SOD、CAT活性，減少MDA含量，血清和腦組織中羥自由基含量減少，腦組織中DPPH清除能力增強，可能通過筑青生命活素固體飲料配方中的覆盆子發(fā)揮作用，作用機制可能與平衡大腦膽堿能系統(tǒng)，緩解氧化應激損傷有關，但是具體物質基礎和作用方式還有待進一步研究。

綜上所述，該產(chǎn)品可以改善東莨菪堿所致癡呆小鼠的學習記憶障礙，但記憶改善具體作用通路還需要深入的探究。