肉豆蔻與花椒揮發油復配促滲作用的研究

焦穎，張彥，楊黎燕，劉樂樂，郭文皓

西安醫學院（西安 710021）

肉豆蔻和花椒均為“藥食同源”品種且性溫。肉豆蔻能逐氣行滯、開胃消食，對胃腸功能不佳、食欲不振、脾胃虛弱等癥狀有一定的改善作用[1]。花椒則具有溫中降逆的作用，能夠改善胃腸不適、腹脹腹痛等不良癥狀，同時也具有一定的殺菌消炎作用[2-3]。這兩種揮發油成分豐富且藥理活性廣泛，肉豆蔻具有抗菌、抗氧化、抑制炎癥功效，可有效地預防皮膚感染、保護皮膚，促進傷口愈合[4]。花椒則具有較好的麻醉和消炎作用，可減輕透皮吸收時的不適感和透皮過程中的炎癥反應[5]。

苦參堿是濕疹膏、苦參洗劑等外用制劑中苦參的主要成分，但其堿性較大，親脂性和透皮吸收作用較差，通常會加入促滲劑使藥物透皮吸收率增加[6]。植物揮發油成分復雜，具有多種生物活性成分，有分子量小、脂溶性強、易透過體內生物膜和生物利用度高等特點，通常被作為促滲劑加入外用化妝品及外用藥中改善活性成分的透皮吸收效果[7]。但單一植物的活性成分有限，很難達到理想效果，復配能實現功能上的協同、互補[8]，被廣泛應用于食品、化妝品等領域。

此試驗將肉豆蔻和花椒揮發油進行復配，采用Franz擴散池法，以大鼠腹部皮膚為模擬皮膚，進行體外透皮試驗，探究其透皮促滲的效果，有望為肉豆蔻和花椒復配揮發油在透皮促滲作用提供理論依據和試驗依據，擴大其在食品香料、化妝品等領域的應用。

1 材料和方法

1.1 材料

肉豆蔻（廣東）；花椒（陜西太白縣綠潤生態農產品有限公司）。

1.2 試劑

純化水（四川卓越水處理設備有限公司）；苦參堿（≥98%，批號HR21415S1，寶雞辰光生物科技有限公司）；卡波姆940（99%，廣州市歐研化妝品有限公司）；氮酮[含量≥97%，國藥控股星鯊制藥（廈門）有限公司]；0.9%生理鹽水（四川科倫藥業股份有限公司）；乙腈（色譜純≥99.9%）、無水乙醇（色譜純≥99.7%）、正己烷（色譜純≥99.5%）：天津市科密歐化學試劑有限公司；磷酸（含量≥85%，茂名市雄大化工有限公司廣州分公司）；異丙醇（色譜純，天津市大茂化學試劑廠）；甲醛（分析純，西安富力化學廠）。

1.3 主要儀器與設備

RYJ-6B型藥物透皮擴散試驗儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；安捷倫1220LC型高效液相色譜儀（AgiLent TechnoLoies System G42868）；JA2003型分析天平（上海越平科學儀器有限公司）；揮發油提取器、EP管等。

1.4 動物

SD大鼠，體重200 g，動物證號：SCXK（川）2022-030（成都達碩實驗動物有限公司），SPF級西安醫學院基轉所飼養，使用許可證編號：SYXK（陜）2022-004。

1.5 方法

1.5.1 水蒸氣蒸餾法提取植物揮發油

參考文獻[4]肉豆蔻碾碎并稱取50 g加入10倍量水浸泡2 h，用揮發油提取器提取8 h，得透明色具有清香氣味的肉豆蔻揮發油。參考文獻[5,8]將100 g花椒碾碎，加入500 mL純水，用揮發油提取器提取4 h得淺黃色具有清香氣味的花椒揮發油。

1.5.2 供試品凝膠的制備

精密稱取75 mg苦參堿標準品，置于250 mL的容量瓶中，加水使之溶解并定容，得0.3 mg/mL的苦參堿溶液。稱取4 g卡波姆940凝膠基質放入200 mL燒杯中，加入5 mL甘油，攪拌使甘油與卡波姆混勻，再緩慢分次加入200 mL 0.3 mg/mL的苦參堿溶液，攪拌混勻，密封放置，使之充分溶脹，制成200 mL苦參堿凝膠[9-10]。

每份10 mL苦參堿凝膠，共17份。其中，4份加入2%，4%，6%和8%的氮酮，4份加入2%，4%，6%和8%的肉豆蔻揮發油，4份加入2%，4%，6%和8%的花椒揮發油，4份加入2%，4%，6%和8%的肉豆蔻、花椒1∶1復配揮發油，剩余一份作為空白對照，攪拌均勻，密封保存備用。

1.5.3 體外透皮擴散試驗

離體鼠皮的制備：將大鼠處死，去除其腹部的毛，迅速剝取腹部皮膚，去除皮下脂肪等組織，用生理鹽水反復沖洗直至洗液澄清，剪成面積約5 cm2大小，置于盛有0.9%生理鹽水的燒杯中備用[9-10]。

在接收池中加入30%的乙醇生理鹽水作為接收液，將處理好的鼠皮固定在擴散池的供給池與接受池之間，用手術剪剪去多余皮膚，真皮一側與接收液接觸，傾斜排盡氣泡，并在供給池（擴散面積為3.14 cm2，容積為8 mL）的供給面上均勻涂上供試凝膠。將接收池置于恒溫（37±1 ℃）調控磁力攪拌器上，并以恒定的速度攪拌接收液，平行做三組。每隔一定時間從接收池中取出1 mL接收液，并向接收池中補加等量的接收液[9-10]。

1.5.4 高效液相色譜測定苦參堿含量

苦參堿標準品溶液制備：精密稱取苦參堿標準品1 mg，加入乙腈-無水乙醇（80∶20，V/V）溶液使之溶解并定容，制成質量濃度為0.1 mg/mL的苦參堿標準品溶液。

色譜條件[10]：選用色譜柱Kromasil NH2柱（5 μm，100 A，250×4.6 mm）；乙腈-無水乙醇-3%磷酸（80∶10∶10，V/V）作為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫：室溫，檢測波長220 nm；進樣量10 μL。

由1.5.3小節得到的接受液作為樣品經0.45 μm的微孔濾膜過濾后，供HPLC進樣分析。測定峰面積值，計算樣品中苦參堿的濃度。

1.5.5 高效液相方法學考察

線性關系考察：精密稱取0.02 g苦參堿溶于100 mL的容量瓶，用乙腈-無水乙醇定容，得到質量濃度為0.2 mg/mL的苦參堿溶液，再分別吸取5，10，15，20和25 mL 0.2 mg/mL的苦參堿溶液至100 mL容量瓶，加乙腈-無水乙醇稀釋至刻度，得到質量濃度分別為0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL的苦參堿溶液，搖勻。吸取上述苦參堿溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程[10]。

精密度試驗：精密吸取1.5.4小節中質量濃度為0.1 mg/mL的苦參堿標準品溶液，按照1.5.4小節中的色譜條件連續進樣6次，記錄其峰面積，計算相對標準偏差（SRSD）[10]。

穩定性試驗：取含有肉豆蔻揮發油和花椒揮發油各0.3 mL的接受液，與室溫下放置，分別在0，4，6，8，10和12 h后按1.5.4小節中的色譜條件進樣，記錄其峰面積。計算SRSD[10]。

重復性試驗：取6份含有濃度為6%的復配揮發油的接受液，1 h后按1.5.4小節中的色譜條件連續進樣，記錄峰面積。計算SRSD[10]。

1.5.6 累積透過量及透皮速率

將1.5.4小節所得各樣品的苦參堿濃度代入式（1）和（2）計算苦參堿單位面積累計透過量Qr（μg·cm-2）和透皮速率Js（μg·cm-2·h-1）[9,11]。

式中：C為t時間的濃度測量值，mg/mL；V為每次取樣的體積 mL；S為擴散池有效面積，cm2；T為取樣總的時間間隔，h。

1.5.7 皮膚滯留量Qs的測定

按1.5.3小節試驗進行4 h后，取下擴散池上的皮膚，用棉簽蘸取無水乙醇溶液，擦凈表面及背面殘留的藥物，再將皮膚用剪刀剪碎，用10 mL乙腈-無水乙醇（80∶20，V/V）浸泡3 h，超聲提取30 min后，抽濾，濃縮至3 mL，濾液過0.45 μm濾膜，利用HLPC測定峰面積值，計算樣品中苦參堿的濃度，即得皮膚滯留量[9,11]。

1.5.8 HE染色觀察促滲劑對皮膚組織的影響

將1.5.3小節所得皮膚浸入甲醛固定液中浸泡24 h，乙醇脫水（70% 24 h，80% 24 h，95% 2 h，無水乙醇1.5 h）后，氯仿透明24 h，浸蠟Ⅰ（50～55 ℃）1 h，浸蠟Ⅱ（58～62 ℃）1 h，石蠟包埋（65～70 ℃），冷卻凝固成塊。將包埋好的蠟塊固定于切片機，切成薄片，用乙醇伊紅染色液染色2 min，倒置顯微鏡下觀察氮酮與不同濃度、不同種類的揮發油促滲劑對皮膚表皮細胞與細胞間隙的影響[9,11]。

1.5.9 數據與統計

所有數據均用Excel進行統計計算，數據用均數±標準差（）表示，組間比較在進行方差齊性檢驗后采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 累積透過量

由表1和圖1可知，苦參堿的累積透過量均大于空白組，且隨透過時間的增加而增加。當促滲劑濃度為6%時，累積透過量最大。不同濃度的氮酮，肉豆蔻揮發油，花椒揮發油，肉豆蔻與花椒1∶1復配揮發油對苦參堿的透皮吸收均有促進作用。當促滲劑濃度為6%或8%時，促滲能力由強到弱依次是肉豆蔻與花椒1∶1復配揮發油＞肉豆蔻揮發油＞花椒揮發油＞氮酮。當促滲劑濃度為2%或4%時，促滲能力由強到弱依次是：肉豆蔻與花椒1∶1復配揮發油＞花椒揮發油＞肉豆蔻揮發油＞氮酮。

圖1 累積透過量（μg·cm-2）與濃度，時間關系

表1 累積透過量與濃度、時間關系 單位：μg·cm-2

以滲透時間（h）為橫坐標，累積透過量（μg·cm-2）為縱坐標做苦參堿累積透過量與肉豆蔻揮發油濃度及時間關系圖，結果見圖2。

圖2 苦參堿累積透過量與肉豆蔻揮發油濃度及時間關系圖

由圖2可知，肉豆蔻揮發油濃度為6%時，苦參堿的累積透過量最大，證明此濃度下的肉豆蔻揮發油透皮促滲作用最強，相比較之下，濃度為2%時，累積透過量最小，促滲作用最弱。當濃度為4%和8%時，苦參堿的累積透過量未見明顯差距。

以滲透時間（h）為橫坐標，累積透過量（μg·cm-2）為縱坐標做苦參堿累積透過量與花椒揮發油濃度及時間關系圖，結果見圖3。

圖3 苦參堿累積透過量與花椒揮發油濃度及時間關系圖

由圖3可知，隨著時間的變化，苦參堿累積透過量不斷增加，前3 h透皮效果有明顯差異，3 h后，濃度為2%和8%的花椒揮發油促滲效果未見明顯差距，濃度為4%和6%的花椒揮發油促滲效果也接近，但促滲作用遠遠大于濃度為2%和8%的花椒揮發油。

以滲透時間（h）為橫坐標，累積透過量（μg·cm-2）為縱坐標做苦參堿累積透過量與肉豆蔻，花椒1∶1復配揮發油濃度及時間關系圖，結果見圖4。

圖4 苦參堿累積透過量與肉豆蔻，花椒1∶1復配揮發油濃度及時間關系圖

由圖4可知，隨著時間的變化，苦參堿累積透過量不斷增加，且當肉豆蔻與花椒1∶1復配揮發油濃度為6%時，累積透過量最大。當濃度為8%時，累積透過量雖有所減少，但仍比其他濃度的累積透過量大。

以滲透時間（h）為橫坐標，累積透過量（μg·cm-2）為縱坐標做苦參堿累積透過量與氮酮濃度及時間關系圖，結果見圖5。

圖5 苦參堿累積透過量與氮酮濃度及時間關系圖

2.2 透皮速率

由表2可知，透皮1 h后，透皮速率均呈現下降趨勢。不同種類的促滲劑均在濃度為6%時，透皮速率最快。當加入促滲劑的濃度大于6%時，不同種類促滲劑的透皮速率由快到慢的順序是肉豆蔻與花椒1∶1復配揮發油＞肉豆蔻揮發油＞花椒揮發油＞氮酮；當加入促滲劑的濃度小于6%時，不同種類促滲劑的透皮速率由快到慢的順序是肉豆蔻與花椒1∶1復配揮發油＞花椒揮發油＞肉豆蔻揮發油＞氮酮，且不同濃度促滲劑的透皮速率均大于空白組。

表2 透皮速率與濃度、時間關系 單位：μg·cm-2·h-1

2.3 皮膚滯留量QS

以促滲劑濃度為橫坐標，皮膚滯留量（μg/mL）為縱坐標做圖，結果見圖6。

圖6 苦參堿皮膚滯留量與促滲劑種類及濃度關系圖

圖7 不同促滲劑對大鼠腹部皮膚的影響（HE染色，x100）

由表3與圖6可知，不同濃度揮發油、氮酮的皮膚滯留量遠遠小于空白組。當加入花椒揮發油的濃度為2%，6%和8%時，苦參堿的滯留量與其他促滲劑相比有顯著的差距，從減少苦參堿滯留量方面考慮，花椒揮發油具有較好的促滲作用。

表3 皮膚滯留量與濃度關系 單位：μg/mL

2.4 促滲劑對皮膚組織的影響

空白組皮膚結構完整，角質層完好無損，表皮細胞排列緊密[13]。與空白組相比，加入促滲劑可以增大細胞間隙，對角質層有明顯作用，植物揮發油對角質層破壞遠低于化學促滲劑氮酮。花椒揮發油，肉豆蔻揮發油，復配揮發油均可使皮膚角質層細胞間隙明顯增大，花椒揮發油使細胞間隙略有增大但角質層脂質仍排列整齊，故花椒揮發油促滲對皮膚角質層破壞較小。花椒揮發油和肉豆蔻揮發油復配后細胞間隙增大最為明顯，且角質層結構較為完整，并未完全破壞角質層的有序排列[7]，故肉豆蔻與花椒復配揮發油可提高皮膚通透性，促進藥物透皮吸收。

2.5 高效液相方法學考察

加樣回收率試驗：取已知含有量的接受液6份，精密量取1 mL，加入0.1 mg/mL的苦參堿標準品溶液2 mL，混勻，量取10 μL按1.5.4小節中的色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。

標準曲線的繪制：按1.5.5小節線性關系考察方法依次進行測定，繪制苦參堿標準曲線如圖8所示。

由圖8知，苦參堿回歸方程為Y=4 143.1X+1.277 2，R2=0.999 3線性范圍0.01～0.05 mg/mL，在線性范圍內線性良好。

精密度試驗：按1.5.5小節精密度試驗方法依次進行測定，得到苦參堿峰面積分別為415.096 3，425.456 8，424.783 5，408.658 4，401.845 9和406.485 6，苦參堿平均峰面積為413.721 1，SRSD為2.16%。結果表明該儀器具有良好的精密度。

穩定性試驗：按1.5.5小節穩定性試驗方法依次進行測定，苦參堿峰面積分別為17.045 3，16.048 2，23.453 6，22.387 5，19.483 1和24.987 5，12 h內苦參堿平均峰面積為20.567 5，SRSD為1.75%，表明接受液在12 h內穩定性良好。

重復性試驗：按1.5.5小節重復性試驗方法依次進行測定，苦參堿含量分別為0.015 7%，0.015 2%，0.016 3%，0.015 5%，0.015 4%和0.014 9%，苦參堿的平均含量為0.015 5%，SRSD為2.81%，表明重復性良好。

加樣回收率試驗：按1.5.5小節加樣回收率試驗方法依次進行測定，苦參堿的回收率分別為100.6%，98.55%，97.25%，98.90%，101.55%和98.95%，其平均回收率為99.30%，SRSD為1.54%。表明該方法回收率好。

3 結論與討論

此研究發現揮發油能夠大幅改善苦參堿的透皮效果，顯著地提高藥物在皮膚中的滲透速率，這可能與其改變皮膚角質層的通透性有關。皮膚角質層致密的網絡結構是活性成分經皮吸收的主要屏障，當其所含脂質成分及角蛋白結構構象等發生變化時，可導致其通透性及屏障作用改變[12]。王茵等[8]通過對比不同濃度、不同種類的植物揮發油對苦參堿透皮促滲效果的影響，結果發現肉豆蔻和花椒揮發油復配使用后的促滲效果顯著優于單一使用。有人研究溫熱藥性對揮發油透皮促滲劑皮膚毒性的影響及其機制研究，指出熱性藥揮發油的皮膚細胞毒性顯著大于溫性藥揮發油，皮膚刺激性卻沒有顯著性差異，但兩者均遠低于經典的化學促滲劑氮酮[12]。采用揮發油復配的思路即可提高透皮促滲的效果，又可避免細胞毒及刺激性的問題[8]。此研究提出的肉豆蔻和花椒揮發油復配的解決方法具有一定的創新性。

此研究確定了肉豆蔻揮發油和花椒揮發油對苦參堿透皮促滲吸收的最佳濃度，有較強的應用推廣和深入研究的價值。肉豆蔻和花椒藥食同源，安全無毒[14]，其揮發油可作為原料添加到化妝品，及外用藥中做促滲劑。故未來研究仍需進一步探索肉豆蔻、花椒揮發油復配后透皮促滲的作用機制及成分變化，也需從抗炎、抗感染、擴張皮膚血管等多角度深入研究復配揮發油的生物活性[13-14]。將植物復配揮發油用于食品添加劑和化妝品中促滲，是一種可提高治療效果的有效策略。