食品中苯甲酸和山梨酸檢測方法研究進展

楊忠芳，陳玲，林青雯，張劉寧穎，林舒平，朱風鵑

海南省檢驗檢測研究院三亞分所（三亞 572000）

食品添加劑是為改善食品品質，色、香、味，以及為防腐、保鮮和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或者天然物質[1-4]，已被廣泛應用于工業加工食品中。苯甲酸（benzoic acid，BA）及其鈉鹽和山梨酸（sorbic acid，SA）及其鉀鹽是傳統的食品添加劑，主要用于防止霉菌、真菌、酵母等微生物引起的食物腐敗，苯甲酸和山梨酸通過與微生物的膜、酶、蛋白質和電子傳遞鏈相互作用而發揮抑制作用[5-7]。近年來，隨著工業加工食品的發展突飛猛進，食品添加劑超標事件層出不窮。研究表明過量地攝入苯甲酸和山梨酸會引起敏感個體發生哮喘、蕁麻疹和驚厥等不適反應，嚴重的還可導致神經系統損傷[8-10]。為規范添加劑的使用、保障食品安全，GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[3]對食品添加劑的使用原則、允許使用的食品添加劑品種、使用范圍及最大使用做了規定（見表1），未規定的食品類別根據所屬類別上一級規定，若無規定則為不得使用，因此對檢測方法的選擇和使用要求提出更高要求。隨著食品的種類和加工工藝越來越豐富，食品基質種類也越來越復雜，對檢測方法的要求也越來越高，鑒于此，通過對不同檢測方法的綜述，篩選高效、快速、準確、環境友好的苯甲酸和山梨酸檢測方法，為后續食品安全監督管理提供指導。

表1 食品中苯甲酸和山梨酸允許使用的最大限量

1 苯甲酸和山梨酸的檢測方法概述

國內外應用較為廣泛的苯甲酸和山梨酸檢測方主要有高效液相色譜法（HPLC）[11]、氣相色譜法（GC）[12]、高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[13]、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）等方法。隨著質譜的普及使用，相關報道呈逐年上升趨勢，而分光光度法、離子色譜法和毛細管電泳法等使用不廣泛，近幾年的相關報道也逐漸減少。

1.1 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法是以液體為流動相，采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析[14]。同時也是國內外使用最多的分析方法，GB 5009.28—2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》[15]將其列為第一法，其原理為樣品經水提取，高脂肪樣品經正己烷脫脂、高蛋白樣品經蛋白沉淀劑沉淀蛋白，采用液相色譜分離、紫外檢測器或二極管陣列檢測器（二極管檢測器具有光譜分析功能，可用于進一步確證可疑色譜峰）檢測，外標法定量。該方法以甲醇和乙酸銨溶液作為流動相，從前處理提取到上機檢測操作簡單，且適用于所有食品基質，該方法僅需要高效液相色譜儀便可以實現，普及率較高，但是容易出現假陽性和基質雜峰干擾，且對色譜柱的柱效要求較高，多組分測定時選擇性較差，分離的時間長，難以滿足大批量樣品的快速檢測需求。

1.2 氣相色譜法（GC）

該方法是GB 5009.28—2016《食品安全國家標準食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》中的第二法，其原理為試樣經鹽酸酸化后，用乙醚提取苯甲酸、山梨酸，采用氣相色譜-氫火焰離子化檢測器進行分離測定，外標法定量。該方法僅適用于醬油、水果汁、果醬中苯甲酸、山梨酸的測定。Tungkijanansin等[16]使用固相萃取前處理樣品，頂空進樣-氣相色譜分離測定泰國蝦醬、腌菜、醬油及魚露中的苯甲酸和山梨酸。結果顯示，苯甲酸和山梨酸在5～150 mg/L的濃度范圍具有良好線性關系，回收率83%～109%，精密度4.5%～6.0%。何亞芬等[17]采用優化后的氣相色譜條件，篩選前處理使用的沉淀劑選擇和用量，選擇2.5 mL亞鐵氰化鉀溶液與乙酸鋅溶液為沉淀劑；優化甜蜜素的衍生條件，確定使用5.0 mL 200 g/L硫酸濃度，5.0 mL 50 g/L亞硝酸鈉濃度，酸反應溫度25 ℃，冰浴衍生時間30 min處理。篩選氣相色譜柱，選用HP-5（30 m×0.35 mm，0.25 μm），氣相色譜進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度260 ℃。柱溫程序：升溫70 ℃（3 min）→30 ℃/min→190 ℃（2 min）→30 ℃/min→250 ℃（4 min）。按上述條件進行檢測，經氫火焰光度檢測器同時測定桃酥、月餅、葵花籽、果醬、醬油、醋等樣品中的山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯類、丙酸和甜蜜素，檢測結果回收率高、精密度較好、快速便捷、操作方便，還擴展了桃酥、月餅、葵花籽等食品基質，簡化操作流程，節約人力物力。相比于GB 5009.28—2016的第二法，該方法減少乙醚等易揮發、管制試劑的使用，檢測方法漸漸地趨向環境友好方向發展。

1.3 高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）

該方法是在液相色譜作為分離的基礎上，以質譜作為檢測器進行分析的方法，由于質譜具有高分辨、高靈敏度、高選擇性特點，逐漸成為微量、痕量分析的首選方法。近幾年，質譜的普及率雖然越來越高，但高效液相色譜-串聯質譜法測定苯甲酸和山梨酸的相關的研究也不多。我國現有的標準方法SN/T 2012—2019《出口食醋中苯甲酸、山梨酸的檢測方法 液相色譜及液相色譜-質譜質譜法》[18]也僅適用于食用醋的檢測。丘保福等[19]建立液質聯用法同時測定植物飲料涼茶、冬瓜茶、菊花茶中的3種防腐劑（苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸）和4種甜味劑（安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜），以10 mmol/L乙酸銨和乙腈作為流動相進行梯度洗脫，在電噴霧負離子模式（ESI-）下，用多重反應監測模式（MRM）進行檢測，該方法前處理簡單，靈敏度高。陳燕等[20]建立食品中30種食品添加劑同時檢測的超高效液相色譜-串聯質譜法，經甲醇-乙腈-水（1∶1∶1，V/V）溶液提取，離心，采用超高效液相色譜-串聯質譜儀測定，外標法定量。對白酒、番茄醬、葡萄干和魷魚干4種基質作加標回收測定，回收率為60%～120%，相對標準偏差均＜10%。綜上所述，多食品類別中的苯甲酸、山梨酸高效液相色譜-串聯質譜法測定或將成為新的研究方向。

1.4 氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）

氣相色譜-串聯質譜法是樣品經提取后、凈化后，注入氣相色譜進行分離，分離的化合物進入質譜，以質譜作為檢測器對目標物進行定量和定性分析的方法。該方法具有分析速度快、分離效率高、靈敏度高、專一性強等特點而成為研究關注的熱點。近年來，Wang等[21]采用氣相色譜-質譜法同時測定糕點中12種防腐劑，方法經優化后采用乙腈提取，D4-羥基苯甲酸乙酯為內標經正己烷脫脂、飽和氯化鈉溶液除雜，渦旋，離心，氮吹濃縮至近干，甲醇復溶，上機分析。苯甲酸和山梨酸在2.5～50 μg/mL的濃度范圍內具有良好的線性關系，在低、中、高3個水平的加標回收率為80.73%～90.26%。李燕等[22]采用氣相色譜-串聯質譜法快速測定醬油、牛奶、飲料、黃酒、啤酒、蜂蜜6類食品中3種糠醛和5種防腐劑（苯甲酸、山梨酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯），樣品采用10.0 mL乙腈提取（飲料、黃酒、啤酒、蜂蜜樣品加無水硫酸鎂振蕩提取，醬油、牛奶等復雜基質需加入C18、PSA進一步凈化），離心過濾便可上機測定。離心過濾膜后上機檢測。Ding等[23]首次提出液-液分散微萃取（DLLME）-GC-MS方法測定食品中的7種防腐劑，方法中采用0.5 mL丙酮和0.05 mL三氯甲烷作為提取液，溫和振搖提取后，經離心，三氯甲烷成小液滴聚集在離心管底部，取有機物注入GC-MS分析。該方法提取時間僅需1 min，使用有機溶劑只有0.55 mL，不僅快速，且有機溶劑的使用量較少，對環境比較友好，這或將成為一個新發展趨勢。

1.5 分光光度法

分光光度法利用目標物在特定波長的吸光度與其濃度呈比例的特點，建立回歸曲線來測定樣品中的目標物濃度。白海鑫等[24]基于吸光度的加和性原理，在選定波長254和224 nm下，通過對苯甲酸/山梨酸的吸光度與濃度間的標準曲線進行線性回歸分析所得的斜率，建立了苯甲酸和山梨酸吸光度與濃度的關系方程組，獲得一種無需分離即可同時測定食品中的苯甲酸和山梨酸含量的方法。Danchana等[25]提出利用winR程序進行多元線性回歸處理數據，來測定果汁、醬油、軟飲料中的苯甲酸和山梨酸。分光光度法僅需要一臺分光光度計便可以測定，設備成本低，且操作簡單、快速，但由于其干擾大，該法的使用和研究報道并不多。

1.6 離子色譜法

離子色譜法也是高效液相色譜的一種，主要是利用離子之間對離子交換樹脂的親和力差異而進行分離。且苯甲酸和山梨酸在堿性環境下呈陰離子狀態，因此能通過離子色譜儀的電導檢測器測定。近年來，許晶冰等[26]采用離子色譜法測定肉制品中亞硝酸鹽、硝酸鹽、山梨酸、苯甲酸、安賽蜜5種食品添加劑。鄭晶晶等[27]采用離子色譜法測定醬腌菜中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、糖精鈉、安賽蜜和甜蜜素6種食品添加劑。研究均采用20 mmol/L NaOH溶液提取，基質復雜的還需經過C18、Ag固相萃取小柱凈化后，以氫氧根為淋洗液洗脫，采用電導檢測器檢測。與傳統液相色譜法相比，離子色譜靈敏度高、操作簡單、使用有機溶劑少，是一種非常環保的檢測方法。但同時也具備傳統液相色譜法的缺點，食品基質復雜，對前處理凈化要求高，凈化不好則容易受到未知峰的干擾。

1.7 毛細管電泳法（CE）

毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）法是以石英毛細管為分離通道，高壓直流電場為驅動力的分離檢測技術[28]。張禮春等[29-30]采用毛細管電泳法測定飲料中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯7種防腐劑。采用膠束電動毛細管電泳法快速測定調味品中山梨酸和苯甲酸，采用70 mmol/L的硼砂鹽緩沖液體系（pH 8.3）為電解質溶液，分離電壓14 kV，柱溫25 ℃，于214 nm波長處進行紫外檢測，樣品中山梨酸和苯甲酸在30 min內即可達到完全分離。該法相比于氣相法和高效液相法具有樣品預處理簡單、分離效率高、試劑消耗量少、成本低等優點，高效毛細管電泳較為嬌氣，稍有些改變，對樣品測量重現性影響較大。

2 結語和展望

食品安全關系到人民的身體健康，一直都是人們高度關注的焦點問題，同時也是食品安全監管工作中的一個重要環節。食品添加劑超范圍使用的問題依舊嚴峻，近年來，國家監管部門對苯甲酸、山梨酸等添加劑的使用的監管力度不斷加強，抽檢數量、食品種類不斷增加，這對檢驗檢測技術提出新的挑戰。GB 5009.28—2016《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》中的高效液相色譜法是監管配套的推薦方法，也是使用最為廣泛的方法。但隨著監管力度加大，任務增加，該方法分離的時間長，多組分測定時選擇性較差，易出現假陽性；抽檢的食品種類多，基質復雜，易受到基質雜峰干擾，已難以滿足大批量樣品的快速檢測需求。而高通量、快速檢測、定性準確、靈敏度高的方法如高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）雖有相關研究，但未有相關標準方法的發布，以補充苯甲酸、山梨酸檢測。所以未來質譜方法的深入研究以及相關標準方法的建立是一個很好方向，為食品安全監管需求提供強有力的支撐。