HPLC-MS/MS法測定調味粉中5種罌粟堿含量的不確定度評估

于曉慧 ，石夢璇，程鳳麗，王曉

1.山東特檢科技有限公司（濟南 250000）；2.濟南富美特信息科技有限公司（濟南 250000）

含有嗎啡、可待因等20多種生物堿的罌粟殼，國家市場監管總局已明確禁止在食品中使用[1]。長期食用，會對人體產生很大的傷害，但是，一些商家為達到盈利目的，仍不擇手段，在一些調味粉和調味料中加入，能夠增加食物的美味，贏得消費者的青睞[2]。當前檢測嗎啡、可待因等生物堿含量的方法主要有高效液相法[3-5]、氣相色譜質譜法[6-7]、液相色譜質譜聯用法[8-11]、薄層色譜法[12]、氣相色譜法。用液相色譜質譜聯用方法測定嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因，具有靈敏度高，操作簡單，上機溶液不需要進行衍生操作等優點。試驗選用高效液相色譜-串聯質譜法測定調味粉中5種罌粟殼生物堿。

不確定度的評定是保證試驗分析過程準確性和可靠性的重要手段[13-14]，試驗依據CNAS-GL006—2019《化學分析中不確定度的評估指南》，建立高效液相色譜-串聯質譜法測定調味粉中的嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量的數學模型，分析在含量測定的整個過程中引入不確定度的分量和占比，得到對試驗數據結果產生較大影響的因素，從而為在實際應用場景中使用此方法的操作過程提供合理建議，同時提高調味粉中的嗎啡、可待因等5種罌粟殼生物堿測定結果的準確性和可靠性，為評價檢驗報告提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-MS/MS 8045三重四極桿液質聯用儀（島津公司）；JA31002型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；BK-180J型超聲波清洗器（山東博科儀器有限公司）；UMV-1型多管旋渦混合器（北京優晟聯合科技有限公司）；KL04A型離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）。

乙腈（色譜純，Thermo Fisher）；實驗室用水（一級水，屈臣氏）；甲酸（色譜純，Thermo Fisher）；調味粉（超市購買）；5種罌粟殼生物堿標準品、可待因標準品（北京壇墨質檢科技有限公司）。

1.2 混合標準品溶液的制備

1.2.1 標準品儲備液

精密移取1 mL嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因混標對照品（其中嗎啡、可待因質量濃度25 μg/mL，罌粟堿、那可丁和蒂巴因濃度5 μg/mL）于同一10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，作為混合標準品儲備液，于4 ℃冰箱避光保存，備用。

1.2.2 同位素內標工作液（5 μg/mL）

分別精密吸取嗎啡-D3同位素溶液和可待因-D3同位素對照品（50 μg/mL）各1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成嗎啡-D3、可待因-D3濃度均為5.0 μg/mL的混合內標工作溶液。于4 ℃冰箱中避光保存備用。

1.2.3 系列標準工作溶液

精密移取20，40，80，160，400和800 μL標準儲備液于10 mL容量瓶中，分別精密加入同位素內標工作溶液（5.0 μg/mL）40 μL，用乙腈定容至刻度，得到嗎啡、可待因質量濃度為5，10，20，50，100和200 ng/mL，罌粟堿、那可丁和蒂巴因質量濃度為1，2，4，10，20和40 ng/mL系列標準溶液，內標質量濃度20 ng/mL，現用現配。

1.3 供試液的制備

稱取2 g（精確至0.01 g）超市購買的某品牌調味粉于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加入1～3 mL水，渦旋振蕩30 s，用移液管準確加入15 mL乙腈，密塞，渦旋1 min，超聲處理30 min，取出，加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g無水醋酸鈉的混合粉末，立即渦旋振蕩2 min，使吸附樣品中的全部水分，以4 000 r/min離心5 min，取上清液，以0.22 μm濾膜過濾，取濾液適量，進樣，待測定。

1.4 檢測方法

1.4.1 色譜參考條件

色譜柱Shim-pack GIST C1-AQ HP（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；儀器柱溫40 ℃；流動相流速0.30 mL/min；儀器進樣量2 μL；流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈。梯度洗脫條件：0.5～1.5 min，10%～70% B；1.5～3.5 min，70%～95% B；3.5～5.5 min，95% B；5.5～5.6 min，95%～10% B；5.6～8.0 min，10% B。

1.4.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；采集方式MRM；離子源接口電壓+4.5 kV，-3.5 kV；碰撞氣為氬氣；離子傳輸管溫度250 ℃；接口溫度300 ℃；加熱模塊溫度400 ℃。表1為5種罌粟堿物質的質譜參數。

表1 化合物的質譜參數

2 結果與分析

2.1 不確定度分析

2.1.1 數學模型調味粉中5種化合物含量計算模型如式（1）所示。

式中：X為調味粉樣品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量，μg/kg；c為標準曲線上查得的樣品質量濃度，ng/mL，V為定容體積，mL；m為取樣量，g；

2.1.2 識別和分析不確定度的來源

如圖1所示，HPLC-MS/MS法測定調味粉中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因含量引入的不確定度主要包括稱量調味粉樣品引入的不確定度、標準溶液配制引入的不確定度、調味粉樣品前處理引入的不確定度、樣品重復性試驗、加標回收試驗、計算過程中的標準曲線擬合帶來的不確定度和SHIMADZU LC-MS/MS 8045三重四極桿液質聯用儀引入的不確定度。

圖1 不確定度的來源分析圖

2.2 分析不確定度分量評定

2.2.1 標準品引入的相對標準不確定度urel(s)

2.2.1.1 外標標準品純度引入相對標準不確定度urel(1)

由嗎啡和可待因的標準品證書得，兩者擴展不確定度為0.05 μg/mL，k=2；罌粟堿、那可丁和蒂巴因的標準品證書可得兩者擴展不確定度為0.01 μg/mL，5種標準品純度引入的相對標準不確定度分別為urel(11)=0.05/（25×2）=0.001，urel(11)=0.01/（5×2）=0.001。

2.2.1.2 內標標準品純度引入相對標準不確定度urel(2)

根據嗎啡-D3同位素溶液和可待因-D3同位素對照品標準物質證書得，擴展不確定度為3 μg/mL，k=2，則urel(21)=3/（50×2）=0.030，由內標標準品引入的相對標準不確定度為

2.2.1.3 標準品儲備液配制引入相對標準不確定度urel(3)

在5種化合物標準品溶液配制過程中所用玻璃器具引入的不確定度包含2個。一是溫度引起不確定度，配制嗎啡和可待因標準溶液時，環境溫度為25 ℃，JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》檢定A級玻璃容器的溫度為20 ℃，所以這里考慮的是液體體積膨脹，配制過程中使用乙腈定容，乙腈的膨脹系數為0.001 37，按照均勻分布進行計算，溫度引起液體體積變化產生的不確定度為其中V為玻璃器具的規格。二是玻璃器具區間半寬a產生的不確定度，按照均勻分布產生的不確定度標準不確定度urel(V)=u(V)/V，相對標準不確定度u(V)=按照上述評定方法，在配制標準品儲配液過程使用到的A級玻璃容器有10 mL容量瓶2次和1 mL單線移液管2次，標準儲備液過程中引入的相對標準不確定度urel(3)結果為0.025 49，具體計算結果見表2。

表2 器具引入的不確定度

2.2.1.4 系列標準溶液中引入相對標準不確定度urel(4)

在系列標準溶液配制的過程中用到20～200 μL移液器、100～1 000 μL移液器和10 mL容量瓶。以20～200 μL移液器為例，根據JJG646—2006《移液器檢定規程》規定，使用20～200 μL移液器，移取液體體積20 μL時，最大容量允差為±20×2.0%，按照矩形分布，取K=則20～200 μL移液器（移取體積20 μL）容量允差產生的標準不確定度為0.230 9 μL；已知乙腈的膨脹系數為0.001 37，實驗室溫度為20±5 ℃，由溫度產生的標準不確定度為0.079 1 μL，則由20～200 μL移液器（20 μL）產生的相對標準不確定度為0.011 55。

配制該系列標準工作溶液過程中使用6次10 mL容量瓶（A級）、20～200 μL移液器10次和100～1 000 μL移液器2次，經計算系列標準溶液配制過程中引入的相對標準不確定度urel(4)結果為0.040 63，計算結果見表3。

表3 移液器不同體積引入的不確定度

2.2.1.5 標準物質的相對標準不確定度urel(s)

表2和表3顯示配制標準儲備液和系列標準工作液時，所用到的玻璃器和移液器所引入的不確定度。標準品引入的相對標準不確定度公式為計算得到5種化合物由標準品引入的相對標準不確定度結果，見表4。

表3 移液器不同體積引入的不確定度

表4 標準品引入的不確定度

2.2.2 樣品前處理過程引入的相對標準不確定度urel(y)

前處理過程中帶來的不確定度主要是由調味粉樣品的稱量引起的，稱量樣品使用的天平規格是萬分之一，該天平的允許誤差是0.5 mg，按照均勻分布計算，樣品前處理過程引入的相對標準不確定度為

2.2.3 樣品重復性試驗引入的相對標準不確定度urel(f)

稱取6份同一供空白試品，分別加入64 μL的標準品儲備液、60 μL同位素內標工作液（5 μg/mL），在1.3的前處理條件下進行提取供試液，在1.4的檢測條件下進行測定。根據公式計算，重復性標準偏差為重復性標準不確定度為重復性試驗引入相對標準不確定度為計算結果見表5。

表5 重復性試驗引入的不確定度

2.2.4 回收率試驗引入過相對標準不確定度urel(r)

稱取同一本底空白調味粉試樣6份，分別加入64 μL的罌粟堿混合標準品儲備液、60 μL同位素內標工作液（5 μg/mL），在1.3的前處理條件下進行提取供試液，在1.4的檢測條件下進行測定計算，得回收率標準偏差Sr，回收率引入的標準不確定度為相對標準不確定度為結果見表6。

表6 回收率試驗引入的不確定度

2.2.5 擬合曲線引入相對標準不確定度urel(l)

標準曲線采用最小二乘法擬合，測定系列標準曲線級別為6，測定樣品次數6次，計算殘差標準偏差用最小二乘法擬合標準工作曲線求得樣品中含量過程所引入的標準不確定度公式為相對標準不確定度計算得5種罌粟殼類生物堿在標線擬合過程中相對標準不確定度，見表7。

表7 標準曲線合成引入的不確定度

標準不確定度公式中：SA為標準溶液殘差標準偏差；n為標點的個數；p為測定樣品的次數；c樣為測量樣品的濃度；為系列標準溶液平均濃度；b為標準曲線斜率。

2.2.6 儀器引入的相對標準不確定度urel(i)

由島津LC-MS/MS 8045三重四極桿液質聯用儀器的校準證書可知，urel(i)為2%，按照均勻分布計算，k=2，得儀器引入的相對標準不確定為urel(i)=2%/2=0.01。

2.3 不確定度的合成和擴展

2.3.1 不確定度的合成

根據得到的各個不確定度分量，對相對標準不確定度進行合成，公式為經計算得到嗎啡等五種生物堿的相對標準品不確定度分別為0.058 31，0.063 68，0.053 49，0.071 83和0.079 24。

2.3.2 不確定度的擴展

取置信區間為95%（k=2），U=urel(x)×2x，計算得到調味粉中5種待測物質的擴展不確定度結果分別為8.96，9.72，1.69，2.27和2.49 μg/kg。

2.3.3 結果表示

通過高效液相色譜-串聯質譜法測定調味粉中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因，測定結果分別為76.87±8.96，76.35±9.72，15.77±1.69，15.78±2.27和15.71±2.49 μg/kg。

3 結論

通過對HPLC-MS/MS法測定調味粉中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因這5種罌粟堿化合物的含量測定進行不確定度評估。結果顯示，在整個檢測過程中，比較各個分量的相對標準不確定度，影響比較大的是標準溶液的配制和標準曲線的擬合。在實際的工作中，要求檢測人員優化移取和定容的具體細節，并且定期對試驗人員進行試驗操作和基礎理論培訓，提高檢測結果的穩定性和準確度。通過不確定度的研究，可為調味粉中罌粟堿的檢測提供參考和借鑒。