UPLC-MS/MS法測定食用植物油中乙基麥芽酚的基質(zhì)效應(yīng)

傅群，劉鳳鳴，何毓文，余建兵

吉安市食品藥品檢驗檢測中心（吉安 343000）

乙基麥芽酚是一種廣泛使用的食品用合成香料，但近年來有不法商販將其加入食用植物油中以掩蓋原有的不良氣味而達到以次充好或造假的目的。長期食含有乙基麥芽酚的食品可能出現(xiàn)頭疼、惡心、嘔吐等副作用，并可能導(dǎo)致骨骼和關(guān)節(jié)相關(guān)的某些疾病[1-3]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[4]中明確規(guī)定植物油脂中不得添加任何香精香料。

檢測機構(gòu)依據(jù)市場監(jiān)督管理總局發(fā)布的補充方法BJS 201708《食用植物油中乙基麥芽酚的測定》[5]開展檢測工作。該方法采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，但食用植物油種類繁多，加工方法不盡相同，要想獲得與每個樣品匹配的空白基質(zhì)較為困難。此外，該方法對樣品無凈化步驟，對儀器的污染也較大。

樣品中除分析物以外的組分對分析過程的干擾和分析結(jié)果準(zhǔn)確性的影響被稱為基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）[4]。在質(zhì)譜分析過程中，ME會不同程度地影響方法的準(zhǔn)確度[7-8]，因此對ME進行評估已成為其方法學(xué)評價的一個基本部分[9-10]。

多項研究建議弱基質(zhì)效應(yīng)的分析物，在不影響分析準(zhǔn)確度的前提下，其基質(zhì)效應(yīng)可忽略[11-13]。近年來，對乙基麥芽酚的研究更多集中在對不同樣品基質(zhì)中檢測方法的開發(fā)上[14-16]，對基質(zhì)效應(yīng)進行全面系統(tǒng)的評價鮮有報道。

鑒于檢驗機構(gòu)的實際狀況，依據(jù)BJS 201708《食用植物油中乙基麥芽酚的測定》，以菜籽油、芝麻油、玉米油等多類食用植物油為研究對象，采用提取后基質(zhì)匹配添加法，對其基質(zhì)效應(yīng)開展全面系統(tǒng)評價，評估空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的必要性并探索補償措施，以期在保證分析結(jié)果準(zhǔn)確度的前提下，減少精密儀器的損耗，切實提高檢測效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters BEH C18色譜柱（200 mm×2.1 mm，1.7 μm），Waters VeroTQS超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（沃特斯中國有限公司）；TGL-18M高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；Quintix224-1CN電子天平（德國賽多利斯公司）；SDC-3000多管渦旋混勻儀（深圳逗點生物技術(shù)有限公司）。

乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度1 000 mg/L，壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；甲醇（質(zhì)譜純，上海安譜科技實驗股份有限公司）；甲酸（色譜純，美國SPS公司）；試驗用水符合實驗室一級用水。

所用菜籽油、芝麻油、玉米油，油茶籽油、大豆油、葵花籽油、花生油、食用植物調(diào)和油、米糠油、橄欖油和核桃油均為市場購買或生產(chǎn)企業(yè)現(xiàn)場采樣獲得。

1.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱采用BEH C18色譜柱（200 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；流速0.4 mL/min；進樣量2 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧正離子源式（electrospray ionization，ESI+）；數(shù)據(jù)方式采用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓2 800 V；錐孔電壓35 V；離子源溫度150 ℃；干燥氣溫度500 ℃；干燥氣流速1 000 L/h（氮氣）；錐孔氣流速150 L/h（氮氣）；碰撞氣為氬氣；其他質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。

表2 乙基麥芽酚的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確移取0.50 mL乙基麥芽酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度1 000 mg/L），用甲醇定容至100 mL，制備成5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，于-18 ℃儲存。將標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為2.5，5.0，25.0，50.0，200.0和500.0 μg/L的溶劑匹配標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，置4 ℃冰箱內(nèi)避光保存，待測。

1.4 空白基質(zhì)溶液制備

準(zhǔn)確稱取10 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL聚丙烯離心管中，用移液器準(zhǔn)確加入10 mL甲醇，在2 500 r/min條件下渦旋振搖2 min，在4 ℃條件下按9 000 r/min離心10 min，將上清液移入20 mL具塞刻度試管中，下層油液用10 mL甲醇重復(fù)提取1次，合并上清液，用甲醇定容至20 mL，經(jīng)微孔濾膜（0.22 μm，有機相）過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.5 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液分別用不同的空白基質(zhì)溶液稀釋至質(zhì)量濃度為2.5，5.0，25.0，50.0，200.0和500.0 μg/L的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍和檢出限、定量限

采用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下測定，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)，建立線性關(guān)系。相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 3，線性關(guān)系良好。以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，結(jié)果見表3。總離子流圖（TIC）和特征離子質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 乙基麥芽酚的總離子流圖（TIC）和特征離子質(zhì)譜圖

表3 乙基麥芽酚的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限

2.2 精密度和回收率

在空白基質(zhì)樣品中分別加入低、中、高3個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。結(jié)果見表4。乙基麥芽酚的平均加標(biāo)回收率為82.7%～95.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.98%～7.93%，結(jié)果表明該方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

表4 乙基麥芽酚的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價方法

評價不同食用植物油的基質(zhì)效應(yīng)強弱，以曲線斜率計算基質(zhì)效應(yīng)（ME）[17-18]，見式（1）。

式中：k1為基質(zhì)匹配曲線斜率；k2為溶劑曲線斜率。

若ME=100%，說明無基質(zhì)效應(yīng)；若ME＜0，呈基質(zhì)抑制效應(yīng)；若ME＞0，呈基質(zhì)增強效應(yīng)。當(dāng)|ME|＜20%時為弱基質(zhì)效應(yīng)；20%≤|ME|≤50%為中等基質(zhì)效應(yīng)；|ME|＞50%時為強基質(zhì)效應(yīng)[17-19]。

2.4 食用植物油基質(zhì)效應(yīng)評價

選取11種常見的食用植物油，共42個樣品，樣品的具體信息和基質(zhì)效應(yīng)見表5。42個樣品全部呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，|ME|在1.8%～39.2%。14號芝麻油的|ME|最強，為39.2%；37號橄欖油的|ME|最弱，為1.8%。其中34個樣品表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)，其色澤主要為淡黃色、淺黃色和黃色。而其余8個樣品都為中等的基質(zhì)效應(yīng)，其色澤為橙黃色、棕色以及棕褐色。淡黃色和淺黃色樣品的|ME|≤6.1%，如一級菜籽油、一級油茶籽油、一級大豆油、橄欖油和核桃油；黃色樣品的|ME|有所增加，但也都在16.8%以下。隨著樣品色澤的加深（從橙黃色、棕色至棕褐色），|ME|也從19.5%逐步增大至39.2%。這種趨勢在同種食用植物油中也很明顯。如1～9號菜籽油，隨著級別降低，樣品的色澤加深，其|ME|從2.5%增大至33.8%。芝麻油以及其他的油類也是如此。

表5 42個樣品的信息和基質(zhì)效應(yīng)

菜籽油和芝麻油由于其自身的產(chǎn)品特點以及民間的土榨工藝較為簡單，所以整體上菜籽油和芝麻油呈色較深的占有會比其他品種的食用植物油更高，尤其是芝麻油。而大豆油、玉米油、調(diào)和油和橄欖油等大部分都呈色較淺，這些油類的基質(zhì)效應(yīng)也相對弱。食用植物油色澤的深淺也在一定程度上反映其雜質(zhì)含量的大小[20-22]。因此推論隨著食用植物油雜質(zhì)含量的增大，色澤加深，其基質(zhì)效應(yīng)也顯著增強。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的補償

強基質(zhì)效應(yīng)對質(zhì)譜分析方法的準(zhǔn)確度具有較大的影響，普遍認為：當(dāng)|ME|≤20%時可忽略；若|ME|≥20%，則應(yīng)采取措施進行補償[23]。通常的補償方法有同位素內(nèi)標(biāo)法[24]、優(yōu)化前處理方法[15,25]、優(yōu)化色譜分離條件[26]和采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線等[27]。

葛敏敏等[15]建立一種全新的前處理方法，有效減少芝麻油的基質(zhì)效應(yīng)，但該方法步驟較為繁瑣。劉川等[24]采用同位素內(nèi)標(biāo)法以減少基質(zhì)效應(yīng)，而同位素內(nèi)標(biāo)物獲得較為困難，價格昂貴。因此，兼顧效率和經(jīng)濟，采用樣品稀釋法開展補償研究。

定義稀釋因子d=樣品基質(zhì)稀釋后體積/樣品基質(zhì)最初體積。為確保方法的檢出限不高于BJS 201708中的25.0 μg/kg，分別考察稀釋因子為2和5時的基質(zhì)效應(yīng)。對比7，8，9，12，13，14，30和36號的樣品基質(zhì)未稀釋和稀釋因子為2和5時的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見圖2。

圖2 不同的稀釋因子對基質(zhì)效應(yīng)的影響（n=3）

從圖1可以看出，隨著稀釋因子的增大，基質(zhì)效應(yīng)明顯減弱，稀釋因子為5時，8個樣品的|ME|均在10%以下，呈現(xiàn)出較弱的基質(zhì)效應(yīng)。試驗中標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為2.5～500 μg/L，稀釋因子為5時，方法的檢出限為25.0 μg/kg。因此在滿足靈敏度要求的前提下，對樣品進行適當(dāng)稀釋有助于減小基質(zhì)效應(yīng)，并能減小至可忽略的程度。

3 結(jié)論

以BJS 201708為依據(jù)，考察乙基麥芽酚在菜籽油、芝麻油、玉米油，油茶籽油、大豆油、葵花籽油、花生油、食用植物調(diào)和油、米糠油、橄欖油和核桃油11種共42個樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，其中34個樣品為弱基質(zhì)效應(yīng)，其余8個樣品為中等基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)與食用油的種類無明顯關(guān)系，而是隨著樣品色澤的加深而表現(xiàn)出增加的趨勢。對8個具有中等基質(zhì)效應(yīng)的樣品進行稀釋，稀釋因子為5時，樣品的基質(zhì)效應(yīng)均減小至可被忽略（|ME|最高為9.9%）。

因此建議在日常檢測工作中，對呈色較淺（淺黃色至黃色）的樣品可直接用溶劑配制工作曲線（2.5～500 μg/L）進行定量，而對呈色較深（橙黃色至棕褐色）的樣品可進行適用的稀釋后采用溶劑配制工作曲線進行定量，提高檢測效率的同時減少對精密儀器的損耗。同時，試驗結(jié)果可為乙基麥芽酚國標(biāo)方法的建立提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)參考。