HPLC法測定保健食品中B族維生素的6種化合物的方法優(yōu)化

胡文森 ，楊路寬，欒奕

1.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院（貴陽 551400）；2.貴州勘設(shè)食品安全科技有限公司（貴陽 550018）

維生素B6（vitamin B6）也叫吡哆素，包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在人體內(nèi)以磷酸酯的形式存在，是人體內(nèi)某些輔酶的組成成分，參與多種代謝反應(yīng)，特別是和氨基酸代謝有密切關(guān)系。長期缺乏維生素B6會使皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及造血機能的損傷。其主要測定方法有毛細管電泳法、超臨界流體色譜及高效液相色譜法（HPLC）等[1]。

維生素B1（vitamin B1），又稱硫胺素或抗神經(jīng)炎素，以輔酶形式參與體內(nèi)糖的分解代謝，具有神經(jīng)保護功能，還可以促進腸胃蠕動，增加食欲，是一種常見的輔助藥物。長期缺乏維生素B1會造成糖代謝障礙，引起多發(fā)性神經(jīng)炎及腳氣病。其測定方法主要有紫外-可見分光光度法、熒光分光光度法、化學(xué)分析法、HPLC等[2]。

煙酰胺（nicotinamide）又名尼克酰胺，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶Ⅰ）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（輔酶Ⅱ）的重要組成部分，與人體內(nèi)脂質(zhì)代謝、組織呼吸的氧化過程以及糖類無氧分解過程有密切的聯(lián)系[3]；主要存在于腎、肝、肌肉、乳汁、蛋黃、花生和水果中[4]，對糙皮病有預(yù)防作用。在蛋白質(zhì)和糖類的代謝中發(fā)揮作用，提高人類和動物的營養(yǎng)，可作化妝品的營養(yǎng)性添加劑，醫(yī)藥及食品、飼料添加劑。

在運用GB/T 5009.197—2003《保健食品中鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、煙酰胺和咖啡因的測定》[5]對相關(guān)指標進行檢測時發(fā)現(xiàn)，鹽酸吡哆醇保留時間在22 min左右，運行時間較長，且鹽酸吡哆醇峰極易與雜峰相連，難達到最小分離度，給實驗者帶來不便。試驗將流動相更換為0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脫，其他色譜條件不變，在保證煙酰胺和鹽酸吡哆醇同時檢測的基礎(chǔ)上，使目標峰與雜質(zhì)峰實現(xiàn)更好分離，且縮短檢測時間、降低檢測成本。通過對檢測結(jié)果線性、準確性、回收率、穩(wěn)定性驗證，給后續(xù)試驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

賽默飛U-3000高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器，美國賽默飛世爾公司）；電子天平[0.1 mg，XP 205，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；渦旋振蕩器（MultiReax，德國Heidolph）。

貴陽市隨機購買的十款保健食品，均在產(chǎn)品標注的保質(zhì)期內(nèi)。

三氟乙酸（分析純，源葉生物）；癸烷磺酸鈉（離子色譜純，SIGMA）；硫酸月桂酯鈉（離子色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；乙腈（色譜純，默克股份有限公司）；甲醇（色譜純，默克股份有限公司）；磷酸[分析純，重慶川東化工（集團）有限公司]；煙酸（0.25 g，DR.Ehrenstorfer GmbH）；煙酰胺（0.25 g，DR.Ehrenstorfer GmbH）；鹽酸吡哆醇（純度≥99.0，廣州沃恩生物科技有限公司）；鹽酸吡哆醛（純度≥99.0，廣州沃恩生物科技有限公司）；鹽酸吡哆胺（純度≥99.0，廣州沃恩生物科技有限公司）；鹽酸硫胺素（純度≥99.0，廣州沃恩生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的制備

分別準確稱取適量煙酸、煙酰胺、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、鹽酸吡哆醛和鹽酸吡哆胺標準品，用水稀釋并定容，扣除純度后得到標準儲備液，質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL。將各標準儲備液逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和50.0 μg/mL的系列混合標準工作液。

1.2.2 樣品前處理

固體試樣：取20粒以上片劑或膠囊試樣研磨或混勻，稱取1 g（準確至0.001 g）試樣于刻度試管中，加入10 mL甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）混合溶液，混勻，超聲萃取5 min后以3 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后待進樣。

液體試樣：取1 g（準確至0.001 g）試樣于刻度試管中，直接用甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）混合溶液定容至10 mL，充分混勻后經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后待進樣。

試樣處理液中濃度超出標準工作液范圍的，用甲醇-水-磷酸（100∶400∶0.5，V/V）混合溶液稀釋至適當濃度后重新進樣。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）或同等性能的色譜柱，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，波長280 nm，流動相為0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

在GB/T 5009.197—2003中，以癸烷磺酸鈉溶液-乙腈-磷酸（850∶150∶1，V/V）為流動相，如圖1所示，鹽酸吡哆醇的保留時間在22 min左右，檢測時間較長，且鹽酸吡哆醇出峰附近有雜峰。即使更改流動相比例也無法實現(xiàn)目標峰完全分離，容易造成檢測結(jié)果不準確。

將流動相替換為0.1%三氟乙酸-甲醇梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。標準品色譜圖與陽性樣品色譜圖如圖2和圖3所示。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

圖2 標準品色譜圖

圖3 陽性樣品色譜圖

由圖2和圖3對比可知，樣品中目標物質(zhì)保留時間大幅提前，而且沒有出現(xiàn)雜峰干擾的情況。

2.2 方法的線性關(guān)系

在上述色譜條件下，配制系列質(zhì)量濃度混合標準溶液，以響應(yīng)峰面積（y）對標準的質(zhì)量濃度（x）做校正曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，如表2所示。

表2 6種化合物的線性關(guān)系

2.3 回收率、精密度與檢出限

試驗選擇陰性的樣品作基質(zhì)進行加標回收。在線性范圍內(nèi)，以高、中、低3個不同濃度進行加標回收測試。如表3所示，樣品中各物質(zhì)的回收率在90%～102%，相對標準偏差均＜5%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》的要求（當含量滿足1 mg/kg＜X≤100 mg/kg時，回收率范圍為90%～110%；當含量滿足10 mg/kg＜X≤1 000 mg/kg時，檢測結(jié)果的準確度偏差＜15%），表明該方法結(jié)果準確。

表3 保健食品中各種維生素的添加回收率結(jié)果

根據(jù)GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分總則》規(guī)定，把3倍空白值的標準偏差（測定次數(shù)≥20）相對應(yīng)的質(zhì)量或濃度稱為檢出限[6]。在最優(yōu)試驗條件下，以信噪比rSN=3為方法檢出限（limit of determination，LOD）。試驗中，當稱樣量為1.00 g，定容體積10 mL時，煙酸、煙酰胺的檢出限為0.004 mg/kg，鹽酸吡哆醇、鹽酸吡哆醛和鹽酸吡哆胺的檢出限為0.001 mg/kg，鹽酸硫胺素檢出限為0.002 mg/kg。

2.4 實際樣品檢測分析

采用本方法對市場上的10個保健食品樣品進行檢測，試驗結(jié)果如表4所示。

表4 保健食品中維生素的測試結(jié)果

3 結(jié)論

試驗改進高效液相色譜法同時檢測保健食品中煙酰胺、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素的含量，在波長280 nm和260 nm下，用流動相為0.1%三氟乙酸-甲醇，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，實現(xiàn)目標峰與雜質(zhì)峰有更好的分離，且縮短檢測時間。該方法操作簡便、準確度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強、回收率高，可作為保健食品中煙酰胺、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素同時檢測的分析方法。