HPLC-MS/MS法測定豬肉中克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇

雙楊，趙燕，夏林林，吳磊磊，陳銀華

1.十堰市食品藥品檢驗檢測所（十堰 442000）；2.十堰市黃龍鎮中心小學（十堰 442000）

瘦肉精根據其結構差異主要分為克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、硫酸特布他林、西巴特羅和鹽酸多巴胺7種[1]。克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇屬于β-腎上腺素受體激動劑類藥物，該類藥物能夠促進動物體內的營養物質重新分配，增加肌肉蛋白沉積，從而顯著提高動物酮體的瘦肉率[2]。因此，該類藥物被大量非法用于畜牧生產，這也導致食用其飼料的動物組織和肌肉中都會存在不同程度殘留。

人類長期食用含有β-腎上腺素受體激動劑類殘留的動物源性食品會對人體健康造成極大的損害，可能會引起急性中毒，患者出現肌肉震顫、心悸、頭部和肌肉疼痛等癥狀[3-4]。我國明令禁止使用克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的使用，但在許多地方仍在非法使用，同時一些肉制品加工企業由于缺乏質量控制意識，原料把關不嚴，使用存在殘留的動物源食品加工，導致市場上一些加工肉制品也含有藥物殘留。

β-腎上腺素受體激動劑類殘留的檢測方法主要有氣相色譜-串聯質譜法[5-6]、高效液相色譜-串聯質譜法[7]、酶聯免疫法[8-9]、電化學法[10]和高效液相色譜法[11]等，各種方法均有其相應的實用性。主要參照GB 31658.22—2022《動物性食品中β-受體激動劑殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》探索高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬肉中β-腎上腺素受體激動劑克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB Sciex QTRAP 4500液相色譜質譜聯用儀（美國AB SCIEX公司）；LYZD-822水浴恒溫搖床（常州金壇良友儀器有限公司）；WH966渦旋混合器（上海康華生化儀器制造有限公司）；高速組織搗碎機（江蘇金壇）；80-1型高速離心機（上海手術器械廠）；B30002電子天平（德國賽多利斯）。

甲醇、乙酸銨、乙酸乙酯、甲酸、叔丁基甲醚（均為色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司）；高氯酸（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；氨水（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；β-葡萄糖醛酶/芳基硫酸酯酶（默克中國）；水為GB/T 6682—2008 《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水（自制）；混合陽離子交換固相萃取柱（60 mg/3 mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）；克倫特羅-D9內標儲備液（濃度100 μg/mL，tmstandard公司）；萊克多巴胺-D6內標儲備液（濃度100 μg/mL，tmstandard公司）；沙丁胺醇-D3內標儲備液（濃度100 μg/mL，tmstandard公司）；克倫特羅標準儲備液（濃度100 μg/mL，壇墨質檢科技股份有限公司）；萊克多巴胺標準儲備液（濃度100 μg/mL，壇墨質檢科技股份有限公司）；沙丁胺醇標準儲備液（濃度100 μg/mL，壇墨質檢科技股份有限公司）。

1.2 標準系列溶液的配制

混合內標工作溶液：精密量取克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3標準溶液各0.5 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成500 ng/mL混合內標工作溶液。

混合標準工作溶液：精密量取克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準溶液各0.5 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成500 ng/mL混合標準工作溶液。

按表1精密量取混合標準工作溶液和混合內標工作溶液，分別用甲醇-0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）定容至25 mL，制成質量濃度分別為1，2，5，10，20和50 ng/mL，內標質量濃度5 ng/mL的標準系列溶液。

表1 標準系列溶液的配制

1.3 樣品溶液的配制

1.3.1 酶解與提取

準確稱取2 g左右樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加6 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖溶液、40 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，于37 ℃避光水浴振蕩16 h，放置至室溫，備用。

1.3.2 萃取、凈化與濃縮

取備用液，加100 μL 100 ng/mL內標工作液，渦旋混勻，按8 000 r/min離心8 min，取上清液，加5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，渦旋混勻，用高氯酸調至pH 1.0，按8 000 r/min離心8 min后，將上清液用10 mol/L NaOH溶液調至pH 10.0。加15 mL乙酸乙酯，中速振蕩5 min，按5 000 r/min離心5 min，取上層有機相。下層水相中加入10 mL叔丁基甲醚，中速振蕩5 min，按5 000 r/min離心5 min，取上層有機相，合并，在50 ℃下氮氣吹干，用5 mL 2%甲酸溶液溶解，備用。

取混合型陽離子交換固相萃取柱，依次用甲醇、2%甲酸溶液各3 mL，活化，取備用液過柱，依次用2%甲酸溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用5%氨化甲醇溶液3 mL洗脫，洗脫液在50 ℃下氮氣吹干。殘留物中加入0.5 mL甲醇-0.1甲酸溶液（10+90，V/V），充分溶解，過0.22 μm微孔濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4 色譜-質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱Kinetex?2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm，美國飛諾美）；流速0.4 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃；流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序見表2。

表2 克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的梯度洗脫條件

1.4.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；監測模式為多反應監測（MRM）；氣簾氣壓力35 psi；噴撞氣壓力9 psi；離子化電壓5500 V；溫度550℃；噴霧氣壓力55 psi；輔助加熱氣壓力55 psi。

1.5 定性與定量測定方法

在同樣的測試條件下，試樣溶液的保留時間與標準溶液保留時間的偏差應在±2.5%之內；試樣溶液中的離子相對豐度比與標準溶液中的離子豐度相比，應符合表3的要求。

表3 試樣溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍

定量采用內標法，克倫特羅以克倫特羅-D9為內標物，萊克多巴胺以萊克多巴胺-D6為內標物，沙丁胺醇以沙丁胺醇-D3為內標物。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

分別取300 ng/mL的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、克倫特羅-D9、萊克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3標準溶液，通過針泵注入質譜系統進行參數優化。在正離子模式下進行全掃描，掃描范圍為質荷比（m/z）200～400，根據質譜圖選擇響應最高的離子作為母離子。不斷增加CE值，改變碰撞能使母離子破碎，選擇響應值較強的2個離子作為定量離子和定性離子，在多反應監測（MRM）模式下，優化碰撞能（CE）及去簇電壓（DP）。優化后的克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的質譜參數見表4。

表4 克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的質譜參數

2.2 色譜柱的優化

選擇高效的色譜柱是檢測克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的基礎，分別選擇色譜柱Kinetex?2.6 μm F5 100A（100 mm×2.1 mm）、Kinetex?2.6 μm Phenyl-Hexyl 100A（100 mm×2.1 mm）及Kinetex?2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm）的3種色譜柱進行試驗，檢測它們對3種化合物的分離效果。結果表明，色譜柱型號Kinetex?2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm）的效果最好，總離子流圖，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇及內標特征離子色譜圖如圖1～圖4所示。因此，選擇Kinetex?2.6 μm C18100A（100 mm×2.1 mm）色譜柱進行試驗。

圖1 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇質量濃度50 ng/mL時的總離子流圖

圖2 克倫特羅及內標特征離子色譜圖

圖3 萊克多巴胺及內標特征離子色譜圖

圖4 沙丁胺醇及內標特征離子色譜圖

2.3 方法線性范圍的驗證

將配制好的標準系列溶液按照濃度由低到高的順序進樣測定。以待測藥物定量離子峰面積和對應內標定量離子峰面積比為縱坐標，對應的標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準曲線圖譜如圖5所示，線性范圍、線性方程及相關系數見表5。

圖5 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準曲線

表5 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的線性范圍、線性方程及相關系數

由圖5和表5可知，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇在1.0～50.0 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，3種化合物線性回歸方程的相關系數均大于0.999，滿足方法線性要求。

2.4 檢出限和定量限的驗證

2.4.1 檢出限

按GB 31658.22—2022《食品安全國家標準 動物性食品中β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》中取樣量2.00 g，定容體積0.5 mL，檢出限要求0.2 μg/kg計算，此時克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的濃度為0.8 ng/mL，用適量混合標準工作溶液配制濃度0.8 ng/mL的溶液進行測定，測定其信噪比。克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇檢出限相關檢驗數據見表6。

表6 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇檢出限檢驗數據

2.4.2 定量限

按GB 31658.22—2022《食品安全國家標準 動物性食品中β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》中取樣量2.00 g，定容體積0.5 mL，定量限要求0.5 μg/kg計算，此時克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇質量濃度為2.0 ng/mL，用質量濃度2.0 ng/mL混合標準工作溶液進行測定，測得其信噪比。克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇定量限具體檢驗數據見表7。

表7 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇定量限檢驗數據

由表6好表7可知，當使用克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的方法檢出限0.2 μg/kg驗證時，3種化合物測定的性噪比均大于3，滿足方法檢出限的要求；當使用克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的方法定量限0.5 μg/kg驗證時，3種化合物測定的性噪比均大于10，滿足方法定量限的要求。

2.5 回收率的驗證

向陰性樣品中添加克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標準品，添加質量分數水平分別為1.0，4.0和8.0 μg/kg，按GB 31658.22—2022《食品安全國家標準 動物性食品中β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》進行處理檢測。克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種化合物加標回收試驗結果見表8。

表8 陰性樣品中添加克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的回收率

3種化合物克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的回收率在81.0%～94.0%，滿足方法回收率要求。

2.6 精密度的驗證

取添加濃度水平4.0 μg/kg克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇標準品的陰性樣品，按GB 31658.22—2022《食品安全國家標準 動物性食品中β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》進行處理并重復測定7次。克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種化合物測定的相對標準偏差試驗結果見表9。

表9 陰性樣品中添加克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇的精密度（n=7）

重復測定加標樣品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的相對標準偏差分別為1.83%，3.07%和3.50%，滿足方法精密度要求。

3 結論

通過采用高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中的克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇，并從線性、檢出限、定量限、回收率、精密度等方面對方法進行驗證。試驗結果表明：在線性方面，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇在1.0～50.0 ng/mL質量濃度范圍內線性關系良好，3種化合物線性回歸方程的相關系數均大于0.999；在檢出限及定量限驗證方面，當方法檢出限為0.2 μg/kg時，3種化合物測定響應值均大于3，方法定量限為0.5 μg/kg時，3種化合物測定響應值均大于10；在回收率方面，3種化合物克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的回收率在81.0%～94.0%；在精密度方面，重復測定的樣品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的相對標準偏差分別為1.83%，3.07%和3.50%。因此，上述幾個方面均滿足方法驗證要求。