不同釀酒原料發酵香氣成分分析

劉芳，張清玫，王慧琳，易偉,4，彭志云,2,3，鄭佳,2,3

1.宜賓五糧液股份有限公司（宜賓 644000）；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室（宜賓 644000）；3.中國輕工業濃香型白酒固態發酵重點實驗室（宜賓 644000）；4.沈陽農業大學食品學院（沈陽 110866）

中國傳統濃香型白酒是以谷物為原材料，大曲為發酵劑，經固態發酵、蒸餾、儲存、勾兌而成的蒸餾酒[1]。原料是濃香型白酒釀造的物質基礎：一方面生產中采用混蒸混燒的工藝，將蒸餾過程原料揮發的香氣物質帶入酒體；另一方面在發酵過程中，原料又為微生物的生長代謝提供物質基礎[2]。白酒釀酒原料品種眾多，常見主要有高粱、玉米、小麥、糯米和大米，在釀酒界素有“高粱產酒香，玉米產酒甜，小麥產酒糙，糯米產酒綿，大米產酒凈”之說，不同原料因營養物質含量不同，在發酵過程中產生的風味物質也各異。

對釀酒原料的研究主要集中于原料理化性質[3-5]及蒸煮過程中產生的游離態風味物質[6-9]。呂佳慧[2]研究結果表明，釀酒原料中豐富的結合態風味物質在發酵過程經由微生物及酶的作用，轉化為游離態風味物質是原酒風味的重要組分，其含量約為原料中游離態風味物質的2～8倍，由此可見釀酒原料對白酒風味具有重要影響。江偉等[10]采用GC-O-MS技術對5種單一原料釀造白酒的風味物質進行定量分析，并結合感官感官評價分析，結果表明，5種單一糧食釀造白酒中，高粱酒香氣成分及香氣活性物質為單一糧食中最多，通過感官評價分析，結果發現高粱酒以酯香為主、整體協調，其風味在單一糧食中占優勢地位，為單一糧食中最適合的釀酒原料。陸其剛等[11]選擇5種常用釀酒原料，進行固液態發酵模擬試驗與代謝產物分析，結果顯示，單一釀酒原料發酵產生的風味物質各具特色，同一種糧食采用不同的發酵方式其代謝產物也存在較大差異；但單糧發酵存在一定局限性，產生的風味物質種類較單一。Han等[12]比較5種單糧釀造白酒的風味質量及風味物質含量，結果顯示，高粱酒風味最佳，小麥酒次之；大米酒酯類物質含量低，醛類和醇類物質含量較高；進一步研究不同單寧含量的高粱酒，發現單寧含量與酯類物質含量密切相關。

為探究單糧及多糧發酵風味物質特性，以5種單一原料及其混合原料為研究對象，以糖化酶及釀酒酵母為糖化發酵劑，探究單糧及多糧在單一發酵劑的固態發酵體系中的風味物質特性，為釀酒原料的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱、大米、糯米、小麥、玉米、五糧粉（均來自生產車間）。

糖化酶（50 000 U/g，金源生物化工有限公司）；安琪酵母（安琪酵母股份有限公司）；同位素標品ethyl hexanoate-d11、acetic acid-d4、benzaldehyde-d6、2-phenylethyl acetate-d3、benzyl-d7 alcohol、phenol-2,4,6-d3（加拿大C/D/N公司）。

1.2 儀器與設備

刀式研磨儀（GM300，德國Retsch公司）；氣質聯用儀（7890B-5977B，美國Agilent公司）；DB-WAXETR色譜柱（30 m×0.250 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）；Lichrolut EN（200 mg/3 mL）萃取固相小柱（德國Merck公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

分別稱取5種單糧各1 000 g，粉碎后過篩，選擇粒徑3～4 mm的用于后續試驗；五糧粉為已粉碎的車間生產用糧。分別稱取500 g粉碎后的原料，加350 mL熱水（約65 ℃），攪拌均勻后堆積潤糧1 h。原料采用清蒸，待蒸鍋上汽后蒸糧35 min。蒸熟后加入350 mL開水，攪拌均勻后攤量至28 ℃。

1.3.2 接種培養

冷卻后的糧食按以下方法進行處理：加入相當于原料干重0.2%的干酵母（使用前需經2%糖水活化活化30 min）及4 g糖化酶，攪拌均勻后裝入1 000 mL密封發酵罐中，于35 ℃發酵30 d。

1.3.3 固相萃取

稱取10 g樣品，加入20 mL 10%乙醇水溶液，和50 μL 1 000 mg/kg混合同位素內標，渦旋3 min，按10 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜。取10 mL上述濾液上0.5 g Lichrolut EN小柱，用6 mL二氯甲烷洗脫，加入2 g無水硫酸鈉去除殘余水分，將液體轉入干凈的瓶中氮吹至500 μL上機。

1.3.4 GC-MS條件

1.3.4.1 GC條件

載氣為高純度氦氣，流速1 mL/min，不分流，進樣口溫度250 ℃。升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。

1.3.4.2 MS條件

全掃描模式；EI離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描范圍30～350 amu。

1.3.5 定性和定量

1.3.5.1 風味物質性方法

發酵糧食香氣成分定性通過與NIST 14質譜中標準譜圖對比匹配，保留指數根據Kovats法[13]計算后與文獻進行比對后確認。

1.3.5.2 風味物質定量方法

定量采用內標法測定，參考內標質量濃度，以待測成分與內標的峰面積之比計算待測成分的半定量信息，單位以mg/kg表示。

2 結果與分析

2.1 釀酒原料發酵風味物質分析

對發酵后釀酒原料進行定量分析，風味物質主要包括酯類（16種）、酸類（7種）、酚類（6種）、芳香族（5種）、呋喃類（5種）、醇類（5種）、其他類（8種），釀酒原料風味物質組成見圖1。高粱、大米、糯米、小麥、玉米及混合五糧發酵后鑒定到風味物質分別為52，50，45，51，51和51種，表1展示各香氣成分含量。

圖1 釀酒原料發酵香氣成分含量

酯類物質為白酒中重要的呈香物質，5種單糧及混合五糧中，小麥及五糧酯類物質總含量最高。琥珀酸單乙酯為含量最高的酯類物質，在五糧及小麥中含量較高、高粱及大米次之、糯米中含量最低。四大酯中乳酸乙酯含量最高，在5種單糧及混合五糧中其含量具有顯著差異：五糧及小麥中最高，大米次之，高粱及玉米中相對較低，糯米中含量極低。乙酸乙酯含量主要表現為五糧較高，其余糧食含量較相近。酯類物質總含量及四大酯含量均表現為五糧＞小麥＞大米＞高粱＞玉米＞糯米。

芳香族物質是白酒中重要的風味物質，具有香味突出、閾值低的特點。白酒中芳香族物質主要來源于微生物發酵代謝原料中的單寧、蛋白質等[14]。發酵糧食中芳香族物質總含量最高，約為總物質含量的70%～90%，其含量在高粱和玉米中尤為突出。含量最高的芳香族化合物分別為苯甲醇、苯乙醇及苯甲醛。苯乙醇具有玫瑰花香氣，在高粱含量最高、玉米次之，糯米中最少。苯甲醇具有花果香味，在玉米中含量最高；苯甲醛具有杏仁香、堅果香，其含量在蒸煮糧食中較高[15-16]，在5種單糧及混合五糧中含量無明顯差異。

醇類物質在白酒中具有烘托香味的作用，同時還是合成酯類物質的前驅物質，其主要來源于酵母菌代謝糖類和氨基酸[17]。發酵糧食中檢出的5種醇類物質，均為高級醇，現有研究表明，過量的高級醇不僅使白酒呈苦澀味影響口感[18]，對人體也有一定毒害作用，高級醇較乙醇化學結構更復雜，在人體內代謝也更緩慢，過量累積會對人體神經系統產生麻醉和毒害并導致肝損傷[19-20]。發酵糧食中高粱與玉米異丁醇及異戊醇含量相對較高，其中作為單糧釀造白酒常用原料的高粱，異戊醇及異丁醇含量約為五糧的4倍。

酸類物質為白酒中重要的香氣成分，其酸味隨碳鏈的增加而減弱，在發酵單糧及混合五糧中含量均較低。己酸是含量最高酸類物質，具有典型的汗臭味，是濃香型白酒主體香味己酸乙酯的前體物質。糯米己酸含量尤為突出，其余糧食無明顯差異。異戊酸與異丁酸含量僅次于己酸，其含量表現為玉米含量最高、高粱大米次之，五糧與糯米含量最低；丁酸、苯丙二酸、戊酸及丙酸含量較低，其中小麥丁酸及丙酸含量相對較高、玉米中苯丙二酸相對含量較高，大米中戊酸含量相對較高?？v向比較發酵糧食，高粱及五糧酸類物質相對含量較均衡，無含量突出的酸。

白酒中的酚類物質主要來源于釀酒原料中單寧、木質素的降解[21]。酚類物質能夠賦予白酒特殊的香氣：愈創木酚具有水果香、花香，4-乙烯基愈創木酚具有水果香、香瓜味，香草醛具有奶油香、甜香味，苯酚具有墨汁香氣[22]。在5種單糧及混合五糧中，高粱與玉米酚類物質總量最高，苯酚為發酵糧食中含量最高的酚類物質，在高粱中含量最高，五糧次之。發酵糧食中玉米愈創木酚含量最高、高粱次之；4-乙烯基愈創木酚在發酵糧食中含量表現為糯米＞大米＞小麥＞玉米，在五糧中未檢出。玉米中香草醛含量最高，小麥次之、大米及糯米中含量最低。

呋喃類物質主要表現為焦香、堅果香、烤杏仁香味[23]。發酵糧食中的呋喃類化合物主要為糠醛及2,3-二羥基苯并呋喃。小麥中糠醛含量較高、其余糧食中含量極低。2,3-二羥基苯并呋喃為玉米中特有的呋喃類物質，在其余發酵糧食中含量極低。

發酵糧食中共檢出其他類化合物8種，2-甲基四氫噻吩及3-甲硫基丙醇為硫化物。硫化物是一類含量十分少、閾值極低的化合物，該類化合物大多具有卷心菜、腐敗的大白菜、腐敗的韭菜、生洋蔥或炒熟的洋蔥的氣味[24]。2-甲基四氫噻吩在較低濃度時具有烘焙香氣，其在玉米及高粱中含量較高，其余發酵糧食中含量較低且無明顯差異；3-甲硫基丙醇低濃度下具有咖啡香味，其在玉米中含量最高。內酯具有椰香味[25]，閾值低，是白酒中重要的風味物質，發酵糧食中檢出2種內酯，分別為泛酰內酯及丁內酯。泛酰內酯在小麥中含量最高，丁內酯在玉米中含量最高。乙偶姻為白酒中關鍵化合物四甲基吡嗪的前體物質，主要來源于釀酒原料蒸煮過程中發生的美拉德反應，其含量在糯米中最高，在高粱中最低。

2.2 釀酒原料關鍵香氣成分相關性分析

為更直觀描述發酵糧食中風味物質的相關性，使用Rcorrplot包計算Pearson相關系數并繪圖，樣本間相關性系數由-1～1表示，值約接近1則表明其相關性越強。由圖2可知，高粱與玉米相似度最高，相關系數0.91，結合表1各類風味物質含量可知，高粱與玉米發酵體系中芳香族、醇類及呋喃類物質含量較高，酯類化合物含量較低；小麥與五糧相關性較強，相關系數為0.86，小麥與五糧芳香族化合總量相近、酯類化合物含量較高，醇類物質含量相對較低；糯米因其風味物質總量低與其他幾種釀酒原料差異相對較大。

圖2 發酵糧食相關性

3 結論與討論

以高粱、大米、糯米、小麥、玉米，及混合五糧為原料，糖化酶、釀酒酵母為發酵劑進行模擬固態發酵試驗，結果表明，不同原料發酵產生的風味物質存在明顯差異，且與傳統關于釀酒原料特性一致?；谙銡獬煞趾繉Πl酵糧食的分析結果表明，高粱因其原料特性，發酵產生的芳香族物質、酚類物質含量相對較高，因此有“高粱產酒香的”說法，大米發酵產生的香氣成分含量較低但較均衡，與“大米產酒凈”相符。糯米發酵產生的香氣成分種類及含量均為5種單糧中最低，芳香族化合物含量相對其他組分較高，符合“糯米產酒綿”的說法。小麥風味物質組成與五糧最為相似，具有酯類物質含量高的特點。玉米發酵產生的醇類物質含量較高，物質間缺乏協調感，該結果與江偉等[10]的研究結果一致?；旌衔寮Z發酵產生的香氣成分含量較均衡，且酯類物質含量最高，而濃香型白酒主要以己酸乙酯為主體香，采用五糧作為濃香型白酒釀酒原料能更好的突出其香型特點。與單糧發酵相比，五糧發酵產生的高級醇含量最低，酯類物質更多，香氣成分含量較均衡，為最適宜的釀酒原料。